新布尼亞病毒傳播媒介、宿主和蜱傳疾病的人群血清流行病學研究.pdf

1、發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)是新發(fā)的一種自然疫源性疾病，2009年首次在中國被發(fā)現(xiàn)。這種疾病是由一種新發(fā)現(xiàn)的布尼亞病毒引起的。2010年，本人的博士指導教師于學杰教授將其分離出來并命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever withthrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)，簡稱為發(fā)熱伴病毒或新

2、布尼亞病毒，其屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬，是一種分節(jié)段的單股負鏈RNA病毒，基因組包括:L、M和S三個片段。
　　SFTS的病例主要分布于中國中東部的山區(qū)、丘陵地帶。該病的高發(fā)季節(jié)主要集中在每年的四到九月，但發(fā)病時間亦存在地域性差異。該病主要發(fā)病人群是50歲以上的農民，其病死率約為12％～30％。該病以發(fā)熱、白細胞減少、血小板降低為主要癥狀，并伴有全身不適、乏力、頭痛、肌肉酸痛以及惡心和嘔吐等臨床表現(xiàn)，嚴重者出現(xiàn)多器官衰竭致死。病

3、例大部分呈零星的散在分布，也有個別的聚集性病例。已證實，SFTSV可以通過接觸病人血液和分泌物感染，存在人與人間的傳播。
　　發(fā)現(xiàn)至今，關于SFTS的病原、流行特征、臨床診斷和治療的研究均取得一定進展。但SFTSV的傳播循環(huán)模式尚無明確的定論，目前僅局限于對流行區(qū)的家畜、嚙齒類動物和媒介節(jié)肢動物的流行病學調查研究。許多的研究報道，在硬蜱屬的長角血蜱、微小牛蜱、龜形花蜱中檢測到SFTSV。因長角血蜱是中國的優(yōu)勢蜱種，推測長角血蜱可能

4、是中國地區(qū)SFTSV的主要傳播媒介和潛在宿主。
　　近年來，各種新發(fā)和再發(fā)的蜱傳疾病對公共衛(wèi)生安全以及畜牧業(yè)的健康發(fā)展造成很大威脅。為此，本課題主要研究長角血蜱在SFTSV傳播循環(huán)模式中的作用，同時對蜱攜帶的其它病原微生物如無形體和埃立克體進行檢測以及蜱傳疾病的人群流行病學研究，預測相關病原的潛在致病性，為預防和控制蜱傳疾病提供實驗依據和理論指導。
　　目的：
　　1.蜱作為SFTSV的宿主研究
　　1.1.檢測

5、草地未吸血長角血蜱的三個不同生活周期SFTSV的感染率，分析長角血蜱在SFTS傳播中的作用。
　　1.2.建立實驗室SFTSV感染動物模型，探討SFTSV在長角血蜱中的傳播循環(huán)模式。
　　2.SFTSV的核蛋白(NP)的原核表達
　　擬對SFTSV的核蛋白(NP)的全序列進行原核表達，獲取高效表達的重組目的蛋白，用于后續(xù)的健康人群的SFTSV抗體檢測。
　　3.長角血蜱攜帶無形體和埃立克體的檢測
　　檢測草

6、地上長角血蜱無形體和埃立克體的攜帶率，分析無形體和埃立克體的感染對公共衛(wèi)生造成的潛在危害。
　　4.健康人群蜱傳疾病的流行病學調查
　　分析蓬萊市健康人群蜱傳疾病(SFTSV、無形體)的抗體水平情況，掌握其抗體動態(tài)變化趨勢，以期進一步提高對該類疾病的認識，為疫情控制提供流行病學依據。
　　方法：
　　1.2013.5～2013.7和2015.5分別在山東膠南和浙江岱山運用布旗法采集野外草地游離未吸血蜱。
　

7、　2.運用RT-PCR和PCR對草地上長角血蜱攜帶的病原體進行檢測，擴增的陽性產物進行克隆轉化測序，并用Clustal X2.1、MegaAlign、Mega6.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹進行核苷酸、核苷酸序列比對和系統(tǒng)進化分析。
　　3.運用實時熒光定量PCR監(jiān)測染毒昆明小鼠一周內SFTSV病毒載量的變化趨勢。
　　4.運用空斑形成單位法檢測培養(yǎng)收獲的病毒滴度。
　　5.采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)和間接免疫熒光實驗

8、(IFA)檢測染毒昆明小鼠SFTSV抗體水平。
　　6.運用PCR法擴增SFTSV NP基因，并克隆至pET32a載體，構建原核表達載體pET32a-NP，經酶切、測序鑒定后轉化表達菌BL21(DE3)，再經誘導、純化得到pET32a-NP融合蛋白，采用Western Blot驗證融合蛋白pET32a-NP的抗原性。
　　7.2015.11～2016.1在山東省蓬萊市小門家、大柳行、大辛店三個鄉(xiāng)鎮(zhèn)六個行政村運用多階段單純隨機

9、抽樣抽樣方法，采集健康人群血清628份，采用ELISA檢測健康人群血清中無形體和SFTSV抗體。
　　結果：
　　1.長角血蜱作為新布尼亞病毒的傳播媒介、宿主的研究結果
　　1.1.蟀標本SFTSV檢測結果
　　本課題組在山東膠南草地共采集蜱3,300只，其中幼蜱120只，稚蜱1,620只，成蜱1,560只。經過形態(tài)學鑒定和16S rRNA基因分子生物學鑒定，草地上采集到的蜱標本主要是長角血蜱。本次研究山東膠南草

10、地上長角血蜱共有8管SFTSV陽性，以最小感染率計算長角血蜱SFTSV的總感染率為0.2％，幼蜱、稚蜱、成蜱的SFTSV感染率分別為0(0/120)、0.12％(2/1,620)，0.39％(6/1,560)。這一研究表明未吸血長角血蜱可以攜帶SFTSV。
　　1.2.不同時期長角血蜱叮咬染毒小鼠后，長角血蜱SFTSV的感染情況
　　正常幼蜱叮咬染毒小鼠，運用RT-PCR檢測飽血后長角血蜱SFTSV的陽性率為18％(9/50

11、)，蛻皮進化成稚蜱SFTSV的陽性率為11.7％(14/120)。正常稚蜱叮咬染毒小鼠，運用RT-PCR檢測飽血后長角血蜱稚蜱SFTSV的陽性率為20％(2/10)，蛻皮進化成成蜱時SFTSV的陽性率為11.7％(14/120)。13只正常成蜱叮咬染毒小鼠，運用RT-PCR檢測飽血后成蜱SFTSV的陽性率為46.2％(6/13)，產卵孵化成幼蜱時SFTSV的陽性率為53.8％(7/13)。這一研究，表明蜱能經卵和經期傳播SFTSV，蜱是

12、SFTSV的自然宿主。
　　1.3.不同時期染毒長角血蜱叮咬正常小鼠后，小鼠SFTSV的感染情況
　　染毒稚蜱叮咬正常小鼠后，小鼠SFTSV的感染率為40％(4/10);染毒成蜱叮咬正常小鼠，小鼠SFTSV的感染率為20％(2/10)，RT-PCR結果與小鼠SFTSV抗體結果一致。這一研究表明，蜱可以從感染動物獲得SFTSV并能傳播SFTSV給動物，說明蜱是SFTSV的傳播媒介。
　　2.草地游離蜱攜帶埃立克體和無形體

13、檢測結果
　　2.1.蜱標本埃立克體和無形體的檢測結果
　　浙江岱山草地共采集蜱標本780只，其中幼蜱0只，稚蜱630只，成蜱150只。用埃立克體的16SrRNA、gltA和groEL基因特異性引物進行巢氏PCR檢測，以最小感染率計算浙江岱山長角血蜱埃立克體的感染率為0.4％(3/780)，3管均為稚蜱。山東的蜱標本中未檢測出埃立克體。DNA序列分析顯示，來自長角血蜱中的埃立克體與Ehrlichia種屬的16S rRNA同源

14、性為98.3％～99.8％，與E.ewingii的同源性最高。核苷酸序列同源性分析顯示groEL和gltA基因的同源性分別為89.6％～93.8％和68.5％～90.4％，與E.ewingii是在一個分支上。
　　隨機抽取山東膠南蜱標本1,680只，其中幼蜱120只，稚蜱1,200只，成蜱360只。用無形體16S rRNA基因特異性引物進行巢氏PCR檢測，以最小感染率計算山東膠南長角血蜱無形體的感染率為0.18(3/1,680)，

15、其中兩管稚蜱，一管成蜱，無形體的感染率分別為0.17％(2/1,200)和0.28％(1/360)。浙江岱山的蜱標本中未檢測出無形體。核苷酸序列同源性分析顯示來自山東長角血蜱中的16SrRNA與無形體種屬的同源性為99.0％～99.5％。
　　3.蜱傳疾病的人群血清流行病學研究
　　3.1.成功構建了pET32a-NP融合蛋白原核表達載體
　　0.5 mM IPTG，誘導10h，重組目的蛋白pET32a-NP在BL21

16、細菌中獲得高效表達。電泳分析表明目的蛋白以包涵體表達為主，純化后的pET32a-NP融合蛋白具有良好的抗原性。將純化復性后的pET32a-NP融合蛋白作為抗原包被ELISA板，每孔300ng，用于后續(xù)健康人群SFTSV抗體檢測。
　　3.2.蓬萊市健康人群血清流行病學研究
　　3.2.1.SFTSV總陽性率
　　共檢測血清標本628份，其中無形體陽性血清22份，陽性率為3.5％(22/628);SFTSV陽性血清33份

17、，陽性率為5.25％(33/628)。
　　3.2.2.無形體抗體檢出情況
　　三個不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)正常人群無形體抗體陽性率分別為2.84％(6/211)，3.85％(8/208)和3.83％(8/209)。其中，男性無形體抗體陽性率為3.45％(11/319)，女性無形體抗體陽性率為3.56％(11/309);青壯年、中年、老年三個不同年齡組無形體抗體陽性率分別為4.73％(10/211)、4.12％(11/267)和0.67％(

18、1/150)。農民、工人及其他無形體抗體陽性率分別為4.37％(20/458)，1.32％(1/76)，1.06％(1/94)。經卡方檢驗，不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)、性別、職業(yè)之間無形體抗體陽性率沒有統(tǒng)計學差異(p＞0.1)。不同年齡之間無形體抗體陽性率有統(tǒng)計學差異(p＜0.1)。
　　3.2.3.SFTSV抗體檢出情況
　　三個不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)正常人群SFTS抗體陽性率分別為5.69％(12/211)，5.29％(11/208)和4.78％(10

19、/209)。青壯年、中年、老年三個不同年齡組SFTS抗體陽性率分別為3.32％(7/211)，7.49％(20/267)和4％(6/150)。男性SFTS抗體陽性率為4.39％(14/319)，女性SFTS抗體陽性率為6.15％(19/309)。農民、工人及其他人SFTS抗體陽性率為6.55％(30/458)，1.32％(1/76)，2.13％(2/94)。經卡方檢驗，不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)、性別之間SFTS抗體陽性率沒有統(tǒng)計學差異(p＞0.1)。不

20、同年齡、職業(yè)人群SFTS抗體陽性率有統(tǒng)計學差異(p＜0.1)。
　　結論及意義：
　　1.草地未吸血長角血蜱可攜帶SFTSV、無形體和埃立克體，說明長角血蜱是這些病原菌的和病毒的自然宿主。
　　2.不同時期的長角血蜱叮咬染毒小鼠后，運用RT-PCR檢測飽血和蛻皮后的長角血蜱SFTSV的陽性率，證實SFTSV在長角血蜱體內能經期傳播;成蜱叮咬染毒小鼠后，運用RT-PCR檢測飽血的成蜱陽性，產卵后幼蜱陽性，證實SFTSV在

21、長角血蜱體內存在經卵傳播。這一試驗證明長角血蜱是SFTSV的儲存宿主。
　　3.RT-PCR檢測證明長角血蜱能夠從染毒小鼠獲得SFTSV,也能將SFTSV傳播給小鼠，證明蜱是SFTSV的傳播媒介。
　　4.蓬萊市健康人群中SFTSV和無形體抗體陽性率較高，提示蓬萊市存在SFTSV和無形體的流行及隱性感染。不同職業(yè)的人群的感染率不同，這主要是因為不同人群與蜱接觸機會不同，我們需加強易感人群對無形體和SFTSV感染的的預防意識，