新型A2A受體拮抗劑的藥物篩選和抗PD活性研究.pdf

1、目的：利用虛擬篩選結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)全新結(jié)構(gòu)且具有較高活性和選擇性的A2A受體小分子拮抗劑，并初步探討拮抗劑在大鼠僵住癥模型上的效果。
　　方法：培養(yǎng)A2A受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞，收集細(xì)胞后勻漿裂解，低速離心去除核及未裂解的細(xì)胞，超高速離心收集細(xì)胞質(zhì)膜成分，測定濃度后取50~70μg/管采用放射性配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)法測定；同樣，培養(yǎng)A1受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞，同法收集細(xì)胞質(zhì)膜成分，測定濃度后取30~50μg/管測定；篩選

2、時，先用100μM化合物初篩，初篩使用兩副孔，重復(fù)一次。初篩后選擇抑制率大于80％的化合物進(jìn)行復(fù)篩，復(fù)篩做化合物濃度-特異性結(jié)合曲線，化合物濃度范圍為100μM~1nM/0.1nM，每濃度使用兩副孔，從曲線中通過GraphPad Prism計(jì)算得到Ki及IC50，重復(fù)一次。通過放射性配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)篩選，確認(rèn)對A2A具有親和力，且相對于A1而言有選擇性的化合物，進(jìn)行細(xì)胞的功能性評價。功能性評價選用離心收集的A2A-HEK-293活細(xì)胞，將終

3、濃度范圍為100μM~1 nM/0.1 nM的化合物，加入激動劑預(yù)先處理的平衡緩沖液混懸的細(xì)胞中，通過測定cAMP來確證其拮抗活性。最后，優(yōu)選活性較好的A2A受體小分子拮抗劑進(jìn)行體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)，使用氟哌啶醇誘導(dǎo)的僵直大鼠來進(jìn)行小分子拮抗劑的體內(nèi)抗PD作用的研究。
　　結(jié)果：在第一批次篩選的化合物中，選取兩個Ki小于1μM的化合物進(jìn)行功能及抗PD活性測定，證明其A2A受體拮抗活性及抗PD活性良好；在此基礎(chǔ)上，再選取這兩個化合物的32個