Nosema屬微孢子蟲基因組特異共線性區(qū)域的進化與功能分析.pdf

1、DNA作為遺傳物質(zhì)在承載著生命延續(xù)的同時也為分子考古學家研究人類的起源、物種的進化史提供了新的契機。近年來，隨著基因組數(shù)據(jù)庫的豐富和完善，生物學家逐漸發(fā)現(xiàn)接近1/3的物種都具有物種特異基因，鑒于它們大多是隨機產(chǎn)生和自然選擇雙重壓力下被保留下來的“化石”基因，對物種的環(huán)境適應性、自然習性起著很關鍵的作用，有的甚至在人腦和視覺蛋白形成過程中扮演舉足輕重的作用，因此逐漸受到遺傳學家和分子考古學家的青睞。
　　 微孢子蟲做為一種存在廣泛

2、宿主的“無線粒體”原生動物，它們兼具原核細胞和真核細胞的特征，盡管對于它們的進化地位仍然存在爭議，但是近年來，越來越多的研究表明它們是進化地位較低的真核生物，并且目前已被NCBI歸類為真菌類。其中家蠶微孢子蟲（Nosemabombycis）作為首個被鑒定的微孢子蟲，專性寄生于經(jīng)濟昆蟲家蠶，是引發(fā)家蠶微粒子病的病原體。家蠶微孢子蟲能夠在外晃環(huán)境刺激下，成功彈出極絲，將孢原質(zhì)送入宿主體內(nèi)從而成功的寄生，進而引起家蠶生理機能障礙，造成宿主細胞

3、的病變壞死以及組織器官功能的喪失。鑒于其對人類經(jīng)濟生活帶來的巨大危害，目前，家蠶微孢子蟲已被世界各養(yǎng)蠶國家和地區(qū)列為唯一法定檢疫對象。盡管對其研究已有近150年的歷史，但是微粒子病的防控仍然是蠶業(yè)界研究的重點和難點。隨著基因組時代的來臨，人們獲得了越來越多的微孢子蟲基因組序列信息，因此，基于比較基因組學分析，探索不同種屬之間的微孢子蟲的差異基因的種類、數(shù)量及功能，對于研究不同種類微孢子蟲生物學特征，發(fā)掘微孢子蟲與其對應宿主之間的共進化關

4、系，以及為尋找種屬特異的檢測靶標基因，具有十分重要的生物學意義。近年來，本實驗室對家蠶微孢子蟲進行了全基因組框架圖的繪制，基于全基因組序列的數(shù)據(jù)，并結(jié)合已報道的其他微孢子蟲基因組，我們首次鑒定到一段Nosema屬特有的基因組區(qū)域，為哺乳動物寄生性微孢子蟲——兔腦炎微孢子蟲、腸道微孢子蟲和比氏腸道微孢子蟲基因組所缺失。這段Nosema屬微孢子蟲基因組共線性區(qū)域的演化歷程是怎樣的？分布于該基因組特異區(qū)域內(nèi)的編碼基因在家蠶微孢子蟲基因組中扮演

5、什么樣的角色？鑒于物種特異基因在研究微孢子蟲進化史以及不同微孢子蟲間的分子鑒定兩方面的重要性，同時也為了回答上述問題，本論文的主要研究內(nèi)容包括:
　　 1.Nosema屬微孢子蟲特異基因組共線性區(qū)域的鑒定與分析
　　 對家蠶微孢子蟲、兔腦炎微孢子蟲和蜜蜂微孢子蟲的同源基因進行比較分析，發(fā)現(xiàn)家蠶微孢子蟲第32號Scaffold上存在一段Nosema屬特異的基因組區(qū)域，進而在已發(fā)布基因座位信息的六種微孢子蟲中進行基因座位保守

6、性分析，進一步證實該區(qū)域為腦炎屬微孢子蟲及比氏腸道微孢子蟲基因所丟失的基因組片段。通過對其中分布的編碼基因的預測及分析，發(fā)現(xiàn)這段特異的基因組區(qū)域存在兩個編碼序列，基因代號為NBO32g0034和NBO32g0035，前者編碼DNA聚合酶kappa（簡稱NbPolκ），后者NBO32g0035的預測功能未知（簡稱NbOP1），RT-PCR實驗證實這兩個基因均能夠正常轉(zhuǎn)錄。對該區(qū)域上游970bp序列進行啟動子和調(diào)控元件預測，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在保

7、守的TATA框和GC框結(jié)構，并且含有SP1結(jié)合位點、CAP/CRP結(jié)合位點、bZIP(Basci-leucinezipper)轉(zhuǎn)錄因子蛋白、Tst-1結(jié)合位點和c-Myb等參與轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)的調(diào)控基礎序。該區(qū)域的GC含量明顯大于N.bombycis基因組的平均GC含量，并且大量分布DNA類型的轉(zhuǎn)座元件，暗示該區(qū)域是基因組不穩(wěn)定區(qū)域。
　　 2.NbPolκ和NbOP1蛋白的編碼基因序列特征及其染色體定位研究
　　 為了深入

8、了解分布于該段特異基因組區(qū)域內(nèi)的編碼基因特征，我們首先針對NbOP1的編碼基因進行預測及分析，結(jié)果顯示該蛋白在家蠶微孢子蟲基因組中不存在其他拷貝，其序列不具有信號肽，僅含有4個疏水簇，并且富含極性氨基酸，隨后對該位置蛋白的二級結(jié)構進行預測，發(fā)現(xiàn)其包含20個α螺旋和11個β折疊。經(jīng)過克隆測序發(fā)現(xiàn)該基因具有核苷酸多態(tài)性，屬于典型的孤兒蛋白。
　　 隨后，我們對NbPolκ蛋白的編碼基因進行了生物信息分析，確定其D87至L417存在保

9、守的DNA聚合酶kappa功能結(jié)構域，但比典型的真核生物POLK存在N-端和C-端的減縮，但是，這種兩端不同程度的缺失并沒有影響其氨基酸的結(jié)構特征。而用最大似然法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示NbPolκ與其他三種微孢子蟲的POLK聚為一簇，但是這一簇基因卻與真菌界的親緣關系較遠，而是落入了細菌域，并與梭狀芽孢桿菌(Clostridia)親緣關系較近。該系統(tǒng)發(fā)育樹在一定程度上反映了NbPolκ的進化歷程，推測NbPolκ可能水平轉(zhuǎn)移自某一種細

10、菌。
　　 通過對NbPolκ和NbOP1的同源信息檢索，并制備探針進行Southernblot雜交，結(jié)果說明我們所分析的具有Nosema屬微孢子蟲基因組共線性區(qū)域位于家蠶微孢子蟲的第XV染色體上。
　　 3.NbPolκ和NbOP1的在釀酒酵母中的定位
　　 首先采用亞細胞定位導肽預測軟件對這兩個基因進行亞細胞定位預測，結(jié)果顯示NbPolκ可能分布于細胞核或者線粒體中，而NbOP1則具有細胞質(zhì)定位特征。隨后利用

11、釀酒酵母表達系統(tǒng)，檢測其各自的亞細胞定位分布。結(jié)果表明，NbOP1定位于釀酒酵母的細胞質(zhì);而NbPolκ則能夠靶向釀酒酵母線粒體，并且N-端導肽序列對于NbPolκ的定位信號沒有任何影響。這一結(jié)果與克魯斯錐蟲的同源基因TcPolκ能夠具有線粒體定位信號的特征相符合，暗示寄生生活中的NbPolκ的特殊地演化地位及其與典型真核生物Polκ的功能分化。
　　 4.NbPolκ和NbOP1在家蠶微孢子蟲基因組中的功能驗證
　　

12、為了更好的了解這兩個編碼基因在家蠶微孢子蟲基因組的表達定位特征以及其可能存在的功能。我們構建了原核表達載體，通過重組融合蛋白的誘導表達和純化，獲得了與理論分子量一致的重組蛋白，用其免疫小鼠以制備多克隆抗體。免疫印跡結(jié)果顯示所得抗血清特異性較好，能夠識別與理論分子量相近的蛋白條帶。分別用其與成熟孢子和處于增殖期的孢子進行間接免疫熒光，表明NbOP1為一種新鑒定到的位于家蠶微孢子蟲孢壁的蛋白;而NbPolκ則是定位于家蠶微孢子蟲細胞核的參與

13、氧化損傷途徑的蛋白。
　　 5.Nosema屬微孢子蟲基因組特異共線性區(qū)域的進化歷程假說
　　 根據(jù)我們前面對兩個編碼基因的研究，結(jié)合微孢子蟲的物種進化分析，我們通過總結(jié)實驗結(jié)果并提出了該片段在微孢子蟲基因組中進化歷程的假說。假說核心為，微孢子蟲的最近共同祖先(LastCommonAncester,LCA)通過水平基因轉(zhuǎn)移或垂直遺傳獲得Nosema屬微孢子蟲基因組特異共線性區(qū)域，之后，該區(qū)域在微粒子屬與腦炎屬微孢子蟲在物

14、種分化之后各自獨立進化。，NbPolκ的保留可能是為了應對家蠶微孢子蟲和蜜蜂微孢子蟲來自昆蟲宿主的劇烈地氧化應激（酚氧化物酶通路）的攻擊所造成的DNA損傷，但是可能由于功能退化或者功能分化進而NbPolκ僅保留在四種感染昆蟲的微孢子蟲的基因組中中然而，家蠶微孢子蟲物種特異基因NbOP1的保留是由于家蠶微孢子蟲宿主專性適應性需要而衍生出的新的功能基因。當然，這些推論亟待進一步的實驗驗證。
　　 綜上所述，本研究首次對家蠶微孢子蟲物

15、種特異基因進行細致的研究，并同其他微孢子蟲的基因座位保守性進行了比較研究，證實這段Nosema屬微孢子蟲基因組特異共線性區(qū)域中的兩個功能基因均能夠編碼家蠶微孢子蟲生理代謝途徑不可或缺的重要蛋白。最后，結(jié)合前期的分析數(shù)據(jù)我們對該區(qū)域的成因進行了初步探討，并提出微孢子蟲中差異基因序列的形成機制的假說。總之，本研究初步探索了家蠶微孢子蟲專性細胞內(nèi)寄生生活所形成的寄生蟲與宿主協(xié)同進化歷程，同時，也為篩選家蠶微粒子病的分子檢測靶標基因奠定分子生物