雜質(zhì)譜分析技術(shù)在化藥注射劑雜質(zhì)控制中的應(yīng)用研究.pdf

1、藥品安全直接關(guān)系人類健康，是重大的民生和公共安全問(wèn)題。注射劑作用迅速，是臨床應(yīng)用最廣泛、最重要的劑型之一，目前已大量入選國(guó)家基本藥物目錄。近年來(lái)，由于注射劑生產(chǎn)工藝以及滅菌工藝的不合理性引發(fā)的不良反應(yīng)事件時(shí)有發(fā)生。欣弗注射液不良反應(yīng)、刺五加注射液不良反應(yīng)等典型藥害事件，使患者對(duì)注射劑的安全性產(chǎn)生了質(zhì)疑。藥品中存在的各種雜質(zhì)特別是毒性雜質(zhì)與這些不良反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)。鑒于注射劑原料合成工藝、處方組成以及滅菌工藝的復(fù)雜性，雜質(zhì)來(lái)源各異、種類

2、眾多、成份復(fù)雜，而僅依靠傳統(tǒng)單一色譜分析方法很難對(duì)雜質(zhì)信息作出準(zhǔn)確、客觀、完整的判斷。因此，亟需建立一套全面、系統(tǒng)、準(zhǔn)確的注射劑雜質(zhì)分析方法。
　　目前，藥物雜質(zhì)研究普遍采用“雜質(zhì)譜控制”理念，雜質(zhì)譜分析技術(shù)是針對(duì)藥品中的每一個(gè)雜質(zhì)，依據(jù)其生理活性制定相應(yīng)的質(zhì)控限度，即藥品中的所有雜質(zhì)都能被有效的分離，每一個(gè)雜質(zhì)的來(lái)源與結(jié)構(gòu)已知，每一個(gè)雜質(zhì)的生理活性清楚，且質(zhì)控分析方法具有良好的粗放性(ruggedness)。涉及的科學(xué)問(wèn)題可簡(jiǎn)單

3、概括為:復(fù)雜體系樣本的分離分析、微量組分的結(jié)構(gòu)分析和微量組分的毒性評(píng)價(jià)三方面問(wèn)題。然而，當(dāng)前多數(shù)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中雜質(zhì)質(zhì)量控制方法、特定雜質(zhì)和雜質(zhì)的控制限度遠(yuǎn)不能有效控制產(chǎn)品的安全性，亟需進(jìn)一步提升標(biāo)準(zhǔn)。
　　本論文以國(guó)家藥品安全“十二五”規(guī)劃為依托，利用雜質(zhì)譜分析技術(shù)，通過(guò)與其它化學(xué)、生物技術(shù)的交叉結(jié)合，開(kāi)展從工藝分析、雜質(zhì)篩查到雜質(zhì)定向合成、結(jié)構(gòu)確認(rèn)、分離測(cè)定，再到藥理毒性評(píng)價(jià)的系列研究，力圖對(duì)注射劑中的雜質(zhì)組成以及其毒性、藥效關(guān)

4、系進(jìn)行全面深入地分析，為提高注射劑的質(zhì)量及臨床用藥安全提供依據(jù)。
　　本論文研究和發(fā)展了傳統(tǒng)的雜質(zhì)譜分析技術(shù)，以液相分離技術(shù)為基礎(chǔ)，建立和優(yōu)化高效液相色譜方法，有效結(jié)合二維液相串聯(lián)四級(jí)桿軌道阱質(zhì)譜(2DLC-QEMS)、MassFrontier化合物結(jié)構(gòu)解析技術(shù)，將之應(yīng)用于注射劑的雜質(zhì)分離和分析中，采用Derek軟件和Sarah軟件并結(jié)合Ames試驗(yàn)方法對(duì)新發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)的生物特性，尤其是基因毒性開(kāi)展了進(jìn)一步的研究，為多種注射劑雜質(zhì)的國(guó)

5、家標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供了依據(jù)，同時(shí)，也為雜質(zhì)譜分析技術(shù)中關(guān)鍵技術(shù)的發(fā)展和完善提供了新思路、新方法，為化學(xué)藥品的雜質(zhì)研究提供了全新的分析技術(shù)方法。
　　第一部分緒論
　　介紹了本研究課題的背景以及雜質(zhì)對(duì)藥物安全性的影響，并對(duì)雜質(zhì)分析的常規(guī)方法進(jìn)行了總結(jié)分析與概括，綜述了當(dāng)前雜質(zhì)研究現(xiàn)狀及雜質(zhì)譜分析技術(shù)的研究進(jìn)展，闡述了本論文的研究意義和通用方法思路。
　　第二部分米力農(nóng)注射液的雜質(zhì)研究
　　以國(guó)家藥品抽驗(yàn)平臺(tái)為依托，通過(guò)

6、比較分析全國(guó)范圍內(nèi)米力農(nóng)注射液質(zhì)量差異，結(jié)合米力農(nóng)注射液的生產(chǎn)工藝及影響因素試驗(yàn)，采用新建立的液相色譜方法全面分析米力農(nóng)注射液的雜質(zhì)，建立了米力農(nóng)注射液的雜質(zhì)譜;采用液相制備、LC-MS、化學(xué)合成以及1HMR和MS等方法對(duì)雜質(zhì)譜中的主要雜質(zhì)進(jìn)行定性，分離確證了2個(gè)雜質(zhì)，其中雜質(zhì)B為全新結(jié)構(gòu)化合物，并采用Derek軟件和Sarah軟件對(duì)新發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)的生物特性尤其是其基因毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，雜質(zhì)B無(wú)遺傳毒性，但存在皮膚刺激性，與米力農(nóng)注射液臨床不

7、良反應(yīng)中的過(guò)敏反應(yīng)、皮疹等不良反應(yīng)相關(guān)，為降低這些不良反應(yīng)的發(fā)生，將雜質(zhì)B作為風(fēng)險(xiǎn)雜質(zhì)進(jìn)行控制，并根據(jù)ICH雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則并結(jié)合現(xiàn)有的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)修訂了米力農(nóng)及米力農(nóng)注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，已被《中國(guó)藥典》2015年版收錄為法定標(biāo)準(zhǔn)，用于全國(guó)米力農(nóng)注射液的質(zhì)量控制。同時(shí)，雜質(zhì)B已獲得國(guó)家發(fā)明專利授權(quán)，研究成果已被中國(guó)食品藥品檢定研究院應(yīng)用，發(fā)行的雜質(zhì)B對(duì)照品用于全國(guó)米力農(nóng)注射液的質(zhì)量控制。
　　第三部分氨酪酸注射液的雜質(zhì)研究
　

8、　本研究采用雜質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)氨酪酸及氨酪酸注射液中的雜質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的分析與研究，通過(guò)制備工藝的比較分析并結(jié)合國(guó)內(nèi)不同地域來(lái)源樣品的測(cè)定結(jié)果，確定了氨酪酸樣品中存在的雜質(zhì)，進(jìn)而采用2D-LC-QEMS和MassFrontier推測(cè)出雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，采用化學(xué)合成及UV、IR、MS、1H-NMR及LC-MS對(duì)未知雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證和一致性確認(rèn)。雜質(zhì)Ⅱ作為氨酪酸雜質(zhì)采用創(chuàng)新性的合成方法進(jìn)行制備，解決了氨酪酸質(zhì)量控制的關(guān)鍵性問(wèn)題，目前該合成工藝已獲得國(guó)

9、家發(fā)明專利授權(quán)，專利號(hào)ZL201510077458.1。采用Derek軟件和Sarah軟件對(duì)雜質(zhì)Ⅱ的生物特性，尤其是基因毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，基于統(tǒng)計(jì)的QSAR模型的Sarah軟件結(jié)果呈疑似陽(yáng)性(17％);通過(guò)Ames試驗(yàn)對(duì)雜質(zhì)Ⅱ遺傳毒性進(jìn)行了深入的研究，證實(shí)雜質(zhì)Ⅱ無(wú)遺傳毒性，但因雜質(zhì)Ⅱ在氨酪酸注射液中表觀含量較高，且為GABA二聚體結(jié)構(gòu)，可能是引起頭暈、失眠等中樞神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)的主要原因，因此，將雜質(zhì)Ⅱ作為風(fēng)險(xiǎn)雜質(zhì)進(jìn)行了控制。提出了氨酪酸

10、及氨酪酸注射液雜質(zhì)檢查的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)已被國(guó)家藥典委員會(huì)采納，同時(shí)研究成果還被東北制藥集團(tuán)有限公司應(yīng)用于日常的質(zhì)量控制，使我國(guó)氨酪酸及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)處于國(guó)際領(lǐng)先水平。
　　第四部分注射用BC-02的雜質(zhì)研究
　　BC-02作為一種全新的抗腫瘤藥物，雜質(zhì)研究方法未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究從雜質(zhì)分離分析方法的篩選建立、雜質(zhì)的定性分析以及雜質(zhì)的毒性評(píng)價(jià)三個(gè)關(guān)鍵的技術(shù)層面，對(duì)創(chuàng)新藥物BC-02及其制劑的雜質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的分析與研究。探索研究

11、了一種適合于BC-02及其相關(guān)雜質(zhì)分離分析的液相色譜方法，建立了能夠全面反映BC-02相關(guān)工藝與影響因素的雜質(zhì)譜，建立的BC-02雜質(zhì)分析方法已獲得國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局的發(fā)明專利授權(quán)（BC-02的液相色譜檢測(cè)方法專利號(hào)ZL201510077487.8）。采用二維色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜(2D-HPLC-QEplus)和MassFrontier軟件推測(cè)出7個(gè)雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，采用化學(xué)合成的方法對(duì)其中的4個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行全合成，采用液相制備的方法對(duì)個(gè)雜質(zhì)e、雜

12、質(zhì)f進(jìn)行了制備，通過(guò)質(zhì)譜和元素分析方法進(jìn)行了確證。經(jīng)Scifinder化合物庫(kù)檢索，雜質(zhì)e和雜質(zhì)f為全新的化合物。采用Derek和Sarah軟件對(duì)BC-02的7種雜質(zhì)的遺傳毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，除雜質(zhì)g(羥甲基-5Fu)為疑似遺傳毒性外，其余6個(gè)雜質(zhì)的遺傳毒性均為陰性。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，羥甲基5-Fu本身極不穩(wěn)定，且在樣品中未被檢出，不予控制;其他6種雜質(zhì)具有肝毒性、眼毒性、皮膚過(guò)敏性等副作用，作為風(fēng)險(xiǎn)雜質(zhì)控制。按照ICH指導(dǎo)原則和國(guó)家局CDE的要

13、求，結(jié)合雜質(zhì)譜分析理念的關(guān)鍵技術(shù)，提出并制定了BC-02雜質(zhì)控制的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使新藥BC-02質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制達(dá)到了國(guó)際領(lǐng)先水平，為雜質(zhì)譜分析技術(shù)在新藥研究中的拓展應(yīng)用提供了良好的示范平臺(tái)。
　　第五部分總結(jié)與展望
　　對(duì)雜質(zhì)譜分析技術(shù)的新發(fā)展和系統(tǒng)分析方法進(jìn)行了總結(jié)，該方法可作為化學(xué)藥品雜質(zhì)分析的通用技術(shù)方法;同時(shí)對(duì)米力農(nóng)注射液、氨酪酸注射液以及注射用BC-02的雜質(zhì)研究過(guò)程和研究成果進(jìn)行了匯總，并對(duì)本研究存在的技術(shù)問(wèn)題和不足進(jìn)

14、行了分析，為進(jìn)一步開(kāi)展后續(xù)研究工作指明了方向。
　　本論文以分析研究發(fā)現(xiàn)的藥品中潛在雜質(zhì)出發(fā)，通過(guò)結(jié)合工藝分析與實(shí)驗(yàn)篩查的發(fā)現(xiàn)途徑，采用現(xiàn)代色譜及聯(lián)用技術(shù)的分析手段，以軟件預(yù)測(cè)毒性評(píng)價(jià)技術(shù)和Ames試驗(yàn)相結(jié)合的生物特性評(píng)價(jià)方式，為藥品中雜質(zhì)的發(fā)現(xiàn)、分離和鑒定、測(cè)定提供了較為全面、系統(tǒng)的研究思路和方法。并對(duì)米力農(nóng)注射液、氨酪酸注射液以及注射用BC-02的雜質(zhì)研究過(guò)程和研究成果進(jìn)行了匯總，為進(jìn)一步開(kāi)展后續(xù)研究工作指明了方向。本論文雜質(zhì)