1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶類廣譜RAF激酶抑制劑的抗腫瘤作用及其作用的分子機(jī)理研究.pdf

1、由RAF激酶介導(dǎo)的RAS/RAF/MEK/ERK通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，到目前為止得到廣泛的研究。該通路中的關(guān)鍵性激酶RAF，可以通過依賴或者不依賴RAS激酶的方式來產(chǎn)生信號(hào)傳導(dǎo)作用。鑒于此，RAF激酶抑制劑已成為當(dāng)前抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)。
　　本文以1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶環(huán)為鉸鏈結(jié)合區(qū)模板設(shè)計(jì)、合成系列新的化合物，評(píng)價(jià)化合物的激酶抑制活性、體外抗細(xì)胞增殖活性，研究體外抗腫瘤作用分子機(jī)理，為發(fā)現(xiàn)活性

2、更高，結(jié)構(gòu)更新穎的的廣譜RAF激酶抑制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　主要研究工作和結(jié)果:
　　1.鑒于1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶核的結(jié)構(gòu)與嘌呤的結(jié)構(gòu)類似，可以通過氫鍵與鉸鏈區(qū)的ATP結(jié)合口袋結(jié)合，可作為激酶鉸鏈結(jié)合區(qū)模板。為了發(fā)現(xiàn)有效的RAF激酶抑制劑，以Sorafenib為先導(dǎo)化合物，用1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶環(huán)代替吡啶環(huán)設(shè)計(jì)出化合物1a，分子對(duì)接顯示1a能與激酶的活性口袋進(jìn)行很好的結(jié)合。以4，6-二氯-5-嘧啶甲醛為原

3、料，經(jīng)成環(huán)、1-NH四氫吡喃保護(hù)、4-苯氧基取代、與芳基異氰酸酯縮合反應(yīng)、脫保護(hù)等反應(yīng)合成1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶衍生物(1a-1t)，以4，6-二氯-5-嘧啶甲醛為原料，經(jīng)成環(huán)、1-NH甲基化、4-苯氧基取代、芳基異氰酸酯縮合反應(yīng)等反應(yīng)合成1-甲基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶衍生物（1u-1v），共22個(gè)目標(biāo)化合物。
　　2.對(duì)上述合成的目標(biāo)化合物進(jìn)行了BRAFV600E激酶活性測試，有12個(gè)化合物在1μM濃度下對(duì)BR

4、AFV600E的抑制率大于60％，其中1v對(duì)BRAFV600E的抑制活性優(yōu)于Sorafenib，其IC50值為23.6nM。細(xì)胞抗增殖實(shí)驗(yàn)顯示大部分化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞（A375、HT-29、PC-3、A549）表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗增殖活性，且對(duì)正常細(xì)胞(MDCK)毒性較小。
　　3.激酶選擇性實(shí)驗(yàn)表明，1v不僅對(duì)BRAFV600E有很好的抑制活性，還對(duì)BRAF(wt)(IC50=51.5nM)和CRAF(IC50=8.5nM)表現(xiàn)出較強(qiáng)的

5、抑制活性。此外，對(duì)其它13種激酶幾乎無抑制活性（抑制率＜30％），結(jié)果顯示1v是具有選擇性的pan-RAF激酶抑制劑。
　　4.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明，1v能抑制A375細(xì)胞的遷移能力，且呈濃度依賴性。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，1v可誘導(dǎo)A375細(xì)胞阻滯在G0/G1期，并將PC-3細(xì)胞阻滯在G2/M期。
　　5.Western blot結(jié)果表明，1v能抑制RAF下游信號(hào)分子MEK的激活，下調(diào)了A375、HT-29細(xì)胞中MEK磷酸化蛋白