三七總皂苷的抗炎鎮(zhèn)痛作用及其配伍對CIA大鼠滑膜RANKL-OPG表達的影響.pdf

1、目的:類風濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性全身性自身免疫性疾病，其病因及發(fā)病機制尚不明確，基本特征為滑膜炎及進行性骨和軟骨破壞，阻止破壞是RA治療的關(guān)鍵。近年來以腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抑制劑為代表的生物制劑是RA治療學的重大突破，但其有效性有限，臨床緩解率尚不理想，同時價格昂貴以及可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)，使其在臨床應(yīng)用中受到了限制。近幾年研究提示天然植物藥有效成分對RA骨破壞可能有治療作用。本課題

2、擬通過①建立小鼠疼痛模型，篩選三七總皂苷(Panax Notoginseng Saponins，PNS)鎮(zhèn)痛的最優(yōu)劑量;②1％角叉菜膠建立小鼠急性炎癥模型，篩選PNS抗炎的最優(yōu)劑量;③建立大鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血清骨保護素(osteoprotegerin，OPG)、細胞核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator

3、of NF-κB ligand，RANKL)以及基質(zhì)金屬蛋白酶-3(Matrix matallprotein-3，MMP-3)的含量，蛋白芯片技術(shù)檢測血清腫瘤壞死因子-a(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)的含量，免疫組織化學法檢測CIA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織OPG、RANKL及骨組織MMP-3的表達，探討RA骨破壞的部分機制及雷公藤多苷聯(lián)合三七總皂苷對實驗性關(guān)節(jié)

4、炎炎癥評分及骨破壞的干預(yù)作用，為RA的臨床治療提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.小鼠疼痛模型的建立與分組痛閾檢測
　　1.1 熱板法將體重18-22g昆明小鼠置于恒溫(55±0.5℃)水浴熱板上，觀察和記錄小鼠自放置熱板至舔后足的時間，以此作為痛反應(yīng)潛伏期。選擇痛反應(yīng)潛伏期10-30S的雌性小鼠40只，隨機分為三七總皂苷低、中、高組(50mg·kg-1、100 mg· kg-1、200 mg· kg-1)、艾瑞昔布組

5、(10 mg·kg-1)及生理鹽水5組，每組8只，灌胃給藥(0.3ml/只)。分別于給藥后0.5h、1.0h、2.0h、3.0h測量小鼠痛閾值變化。
　　1.2 輻射熱刺激法（甩尾法）
　　將體重18-22g昆明小鼠裝入籠中，置于鼠尾光照測痛儀上，光束直射于鼠尾1/3處（尾尖上部約1-2cm，記號筆標記，以便每次光照在同一位置），測量小鼠甩尾所需的時間，以此作為痛反應(yīng)潛伏期。選擇痛反應(yīng)潛伏期為2-6S的雄性小鼠40只，隨機分

6、為三七總皂苷低、中、高組(50mg·kg-1、100 mg·kg-1、200 mg·kg-1)、艾瑞昔布組(10 mg·kg-1)及生理鹽水組，每組8只，灌胃給藥(0.3ml/只)。分別于給藥后0.5h、1.0h、2.0h測量小鼠甩尾所需的時間。
　　1.3 醋酸扭體法將體重18-22g昆明小鼠40只，均為雌鼠，隨機分為三七總皂苷低、中、高組（50 mg·kg-1、100 mg·kg-1、200 mg·kg-1）、艾瑞昔布組（10

7、 mg·kg-1）及生理鹽水組，每組8只，連續(xù)灌胃給藥3d，第3天給藥后1h，按0.1mg/kg腹腔注射0.7％醋酸溶液，觀察5分鐘后，開始記錄此后15分鐘內(nèi)小鼠的扭體次數(shù)（以腹部收縮、軀體扭曲、后肢伸展、蠕行等為判斷標準），并計算抑制率。抑制率=（陰性對照組平均扭體次數(shù)-給藥組平均扭體次數(shù)）/陰性對照組平均扭體次數(shù)×100％。
　　2.角叉菜膠急性關(guān)節(jié)炎模型的建立與炎癥評估將體重18-22g昆明小鼠40只，雌雄各半，隨機分為三七

8、總皂苷低、中、高組(50 mg·kg-1、100 mg·kg-1、200mg·kg-1)、艾瑞昔布組(10 mg·kg-1)及生理鹽水組，每組8只，連續(xù)灌胃給藥3d，第3天給藥后1h，各鼠右足趾皮內(nèi)注射1％角叉菜膠(30ul/只)致炎，分別測量致炎后1h、2h、3h、4h、5h時右后足爪容積，計算各組的腫脹度和腫脹抑制率。腫脹度=致炎后右后足爪容積-致炎前右后足爪容積，腫脹抑制率（％）=（對照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度）/對照組平均

9、腫脹度×100％。
　　3.膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠模型的建立與實驗室指標檢測選擇體重150-180g的Wistar大鼠，雌雄各半。測量體重及足趾容積測量儀測量雙側(cè)足爪容積后，于大鼠尾根部、右后足跖及背部等多處皮內(nèi)注射雞Ⅱ型膠原0.2ml/只，第14d加強免疫，另取6只用同樣的方法注入等量生理鹽水為正常對照組。造模后第21d將成模大鼠隨機分為模型組、來氟米特組(LEF)、雷公藤多苷組(TG)、TG+三七總皂苷(PNS)組，每組

10、6只，并測量大鼠體重及足爪容積。各治療組分別給予LEF(10mg·kg-1)、TG(10 mg·kg-1)、TG(10 mg· kg-1)+PNS(200 mg· kg-1)灌胃(3ml/只),正常對照組和模型組分別給予等量生理鹽水，共6周。灌胃結(jié)束后第2天測量大鼠體重、足爪容積及AI評分。隨即10％水合氯醛腹腔麻醉，腹主動脈取血留取血清，采用ELISA法檢測血清OPG、RANKL、MMP-3含量及蛋白芯片技術(shù)檢測血清TNF-α、IL-

11、6的含量。截取雙側(cè)踝關(guān)節(jié)，固定、脫鈣、脫水、浸蠟、包埋及切片，HE染色置于顯微鏡下觀察組織形態(tài)學改變，免疫組化法檢測踝關(guān)節(jié)滑膜組織OPG、RANKL及骨組織MMP-3的表達。
　　統(tǒng)計學分析:所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，所得結(jié)果以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示。三組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　

12、　1.三七總皂苷對小鼠痛閾的影響
　　1.1 熱板法給藥前各組痛閾無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);給藥0.5h: PNS中、高劑量組及艾瑞昔布組痛閾均高于生理鹽水組(P＜0.01)，PNS低劑量組痛閾高于生理鹽水組(P＜0.05)，PNS各劑量組痛閾均低于艾瑞昔布組(P＜0.01)，PNS低劑量組痛閾低于高劑量組(P＜0.01)，PNS中劑量組痛閾低于高劑量組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);給藥1h: PNS各劑量組及艾瑞昔布

13、組痛閾均高于生理鹽水組(P＜0.01)，PNS各劑量組痛閾低于艾瑞昔布組(P＜0.01)，PNS低劑量組痛閾低于高劑量組(P＜0.01)，PNS中劑量組痛閾低于高劑量組(P＜0.05);給藥2h: PNS各劑量組及艾瑞昔布組痛閾高于生理鹽水組(P＜0.01)，PNS各劑量組痛閾低于艾瑞昔布組(P＜0.01)，PNS低、中劑量組痛閾均低于高劑量組(P＜0.01);給藥3h: PNS各劑量組及艾瑞昔布組痛閾高于生理鹽水組(P＜0.01)，P

14、NS各劑量組痛閾低于艾瑞昔布組(P＜0.01)，PNS低、中劑量組痛閾均低于高劑量組（P＜0.01）。
　　1.2 輻射熱刺激法（甩尾法）
　　給藥前各組痛閾無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);給藥0.5h: PNS各劑量組及艾瑞昔布組痛閾均高于生理鹽水組(P＜0.01)，PNS各劑量組痛閾均低于艾瑞昔布組(P＜0.01)，PNS低、中劑量組痛閾均低于高劑量組(P＜0.05);給藥1h: PNS各劑量組及艾瑞昔布組痛閾均高于生理鹽

15、水組(P＜0.01)，PNS各劑量組痛閾均低于艾瑞昔布組(P＜0.01)，PNS低、中劑量組痛閾均低于高劑量組(P＜0.01);給藥2h: PNS各劑量組及艾瑞昔布組痛閾均高于生理鹽水組(P＜0.01)，PNS各劑量組痛閡低于艾瑞昔布組(P＜0.01)，PNS低劑量組痛閾低于高劑量組(P＜0.01)，PNS中劑量組痛閾低于高劑量組(P＜0.05)。
　　1.3 扭體法
　　PNS中、高劑量組及艾瑞昔布組扭體起始時間均高于生理

16、鹽水組(P＜0.01)，PNS低劑量組扭體起始時間高于生理鹽水組（P＜0.05），PNS各劑量組扭體起始時間均低于艾瑞昔布組（P＜0.01），PNS低、中劑量組扭體起始時間均低于高劑量組(P＜0.05); PNS中、高劑量組及艾瑞昔布組扭體頻率均低于生理鹽水組(P＜0.01)，PNS低劑量組扭體頻率低于生理鹽水組(P＜0.05)，PNS各劑量組扭體頻率均高于艾瑞昔布組(P＜0.01)，PNS低、中劑量組扭體頻率高于高劑量組(P＜0.05

17、)，PNS低、中、高劑量組抑制率分別為12.22％、21.75％、26.71％。
　　2.三七總皂苷對角叉菜膠所致小鼠足腫脹的抑制作用致炎1h: PNS中、高劑量組及艾瑞昔布組腫脹度低于生理鹽水組(P＜0.01)，PNS低劑量組腫脹度低于生理鹽水組(P＜0.05)，PNS低、中劑量組腫脹度高于艾瑞昔布組(P＜0.01)，PNS高劑量組腫脹度高于艾瑞昔布組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，PNS低劑量組腫脹度高于高劑量組(P＜0

18、.01)，PNS中劑量組腫脹度高于高劑量組(P＜0.05)，PNS低、中、高劑量組抑制率分別為25％、60％、77.1％;致炎2h: PNS中、高劑量組及艾瑞昔布組腫脹度低于生理鹽水組（P＜0.01），PNS低劑量組腫脹度低于生理鹽水組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，PNS低、中劑量組腫脹度高于艾瑞昔布組(P＜0.01)，PNS高劑量組腫脹度高于艾瑞昔布組(P＜0.05)，PNS低劑量組腫脹度高于高劑量組(P＜0.01)，PNS中

19、劑量組腫脹度高于高劑量組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，PNS低、中、高劑量組抑制率分別為0.21％、40.3％、57.6％;致炎3h: PNS中、高劑量組及艾瑞昔布組腫脹度低于生理鹽水組(P＜0.01)，PNS低劑量組腫脹度低于生理鹽水組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，PNS低、中劑量組腫脹度高于艾瑞昔布組（P＜0.01），PNS高劑量組腫脹度高于艾瑞昔布組(P＜0.05)，PNS低劑量組腫脹度高于高劑量組(P＜0.01)

20、，PNS中劑量組腫脹度高于高劑量組(P＜0.05)，PNS低、中、高劑量組抑制率分別為0.63％、34.7％、54.5％;致炎4h: PNS中、高劑量組及艾瑞昔布組腫脹度低于生理鹽水組(P＜0.01)，PNS低劑量組腫脹度低于生理鹽水組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，PNS低、中劑量組腫脹度高于艾瑞昔布組(P＜0.01)，PNS高劑量組腫脹度高于艾瑞昔布組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，PNS低劑量組腫脹度高于高劑量組(P＜

21、0.01)，PNS中劑量組腫脹度高于高劑量組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，PNS低、中、高劑量組抑制率分別為20.0％、52.5％、60.3％;致炎5h: PNS中、高劑量組及艾瑞昔布組腫脹度低于生理鹽水組(P＜0.01)，PNS低劑量組腫脹度低于生理鹽水組(P＜0.05)，PNS低、中劑量組腫脹度高于艾瑞昔布組(P＜0.01)，PNS高劑量組腫脹度高于艾瑞昔布組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，PNS低劑量組腫脹度高于高劑

22、量組(P＜0.01)，PNS中劑量組腫脹度高于高劑量組(P＞0.05)，PNS低、中、高劑量組抑制率分別為32.7％、73.4％、88.2％。
　　3.TG、PNS及其配伍對大鼠體重變化的影響造模前各組體重無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。給藥前，模型組(12.69±1.16)、TG組（11.80±1.58）、LEF組（12.02±1.76）、TG+PNS組(12.32±1.73)體重增加值均低于正常對照組(24.42±3.09)(P

23、＜0.01);模型組、LEF組、TG組、TG+PNS組各組間體重增加值無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);給藥6周， TG組（11.30±1.53）體重增加值高于模型組（10.54±1.91），但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，LEF組（15.22±2.44）體重增加值高于模型組(P＜0.05)，TG+PNS組（16.95±4.40）體重增加值高于模型組(P＜0.01); TG組體重增加值低于LEF組(P＜0.05)，TG+PNS組體重增加值高

24、于LEF組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，TG+PNS組體重增加值高于TG組(P＜0.01)。
　　4.TG、PNS及其配伍對大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）變化的影響給藥前，模型組（11.50±1.87）、TG組（11.65±1.05）、LEF組(11.17±0.98)、TG+PNS組(10.97±1.75)組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);給藥結(jié)束后，TG組(6.33±1.21)、LEF組（5.83±0.75）、TG+PNS組

25、（5.66±1.37）AI評分均低于模型組（11.67±1.03）(P＜0.01)，但各用藥組組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　5.TG、PNS及其配伍對大鼠足爪腫脹抑制率變化的影響給藥4周，LEF組(83.92±8.35，73.48±9.53)、TG組（87.02±21.63，79.62±14.15）、TG+PNS組（75.28±14.77，74.91±11.94）雙側(cè)足爪腫脹率均低于模型組(120.16±11.41，10

26、8.65±9.21)(P＜0.01);各用藥組組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05); LEF組、TG組、TG+PNS組雙足平均腫脹抑制率分別為31.26％、27.15％、34.20％;給藥6周，LEF組(64.15±3.48，61.34±8.34)、TG組(70.16±10.99，64.73±8.15)、TG+PNS組(56.65±6.34，53.11±2.99)雙側(cè)足爪腫脹率均低于模型組（120.24±16.73，109.74±16.57

27、）(P＜0.01); TG組雙足爪腫脹率高于LEF組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，TG+PNS組雙足爪腫脹率低于LEF組(P＞0.05)，TG+PNS組雙側(cè)足爪腫脹率低于TG組(P＜0.05)，LEF組、TG組、TG+PNS組雙足平均腫脹抑制率分別為45.38％、41.33％、52.24％。
　　6.TG、PNS及其配伍對大鼠血清OPG、RANKL、MMP-3、TNF-α及IL-6水平的影響
　　6.1 各組血清OP

28、G(pg/ml)水平的比較模型組（2685.87±169.74）、TG組(2371.38±150.74)、LEF組(2071.35±114.98) OPG水平均高于正常對照組(1611.39±105.82)(P＜0.01)，TG+PNS組(1853.16±128.89)OPG水平高于正常對照組(P＜0.05);LEF組、TG組、TG+PNS組OPG水平均低于模型組(P＜0.01);TG組OPG水平高于LEF組（P＜0.01），TG+PN

29、S組OPG水平低于LEF組(P＜0.05)，TG+PNS組OPG水平低于TG組(P＜0.01)。
　　6.2 各組血清RANKL(pg/ml)水平的比較模型組（30.97±1.78）、TG組(26.76±1.33)RANKL水平高于正常對照組(20.01±1.91)（P＜0.01），LEF組（24.55±1.16）、TG+PNS組(22.32±1.18)RANKL水平高于正常對照組(P＜0.05); LEF組、TG+PNS組RAN

30、KL水平低于模型組(P＜0.01)，TG組RANKL水平低于模型組(P＜0.05);TG組RANKL水平高于LEF組（P＜0.05），TG+PNS組RANKL水平低于LEF組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，TG+PNS組RANKL水平低于TG組(P＜0.05)。
　　6.3 各組血清OPG/RANKL比值水平的比較模型組(96.12±7.39) O/R值高于正常對照組(77.52±4.50)(P＜0.01)，TG組（91.4

31、4±2.47）、LEF組（88.31±8.73）O/R值高于正常對照組(P＜0.05)，TG+PNS組(79.68±8.42)O/R值高于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05); TG組O/R值低于模型組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，LEF組、TG+PNS組O/R值低于模型組(P＜0.01); TG組O/R值高于LEF組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，TG+PNS組O/R值低于LEF組，但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05

32、)，TG+PNS組O/R值低于TG組(P＜0.05)。
　　6.4 各組血清MMP-3(ng/ml)水平的比較模型組(21.46±1.71)、TG組（18.78±1.15）、LEF組（16.36±0.93）MMP-3水平均高于正常對照組（12.75±1.10）(P＜0.01)，TG+PNS組（14.72±0.59）MMP-3水平高于正常對照組(P＜0.05); LEF組、TG組、TG+PNS組MMP-3水平均低于模型組(P＜0.0

33、1); TG組MMP-3水平高于LEF組(P＜0.01)，TG+PNS組MMP-3水平低于LEF組(P＜0.05)，TG+PNS組MMP-3水平低于TG組(P＜0.01)。
　　6.5 各組血清TNF-α(pg/ml)水平的比較模型組（166.99±3.44）、TG組（153.69±5.35）、LEF組(144.60±4.08)、TG+PNS組(136.18±3.13)TNF-α水平均高于正常對照組（126.24±4.00）(P＜

34、0.01); LEF組、TG組、TG+PNS組TNF-α水平均低于模型組(P＜0.01);TG組TNF-α水平高于LEF組(P＜0.01)，TG+PNS組TNF-α水平低于LEF組(P＜0.01)，TG+PNS組TNF-α水平低于TG組(P＜0.01)。
　　6.6 各組血清IL-6(pg/ml)水平的比較模型組(104.90±5.38)、TG組（92.18±4.86）、LEF組（83.95±5.78）IL-6水平均高于正常對照組

35、（66.96±4.74）（P＜0.01），TG+PNS組(74.07±4.88)IL-6水平高于正常對照組(P＜0.05); LEF組、TG組、TG+PNS組IL-6水平均低于模型組（P＜0.01），TG組IL-6水平高于LEF組(P＜0.05)，TG+PNS組IL-6水平低于LEF組(P＜0.01)，TG+PNS組IL-6水平低于TG組(P＜0.01)。
　　7.TG、PNS及其配伍對大鼠踝關(guān)節(jié)病理變化的影響病理結(jié)果提示，正常組

36、:關(guān)節(jié)組織未見形態(tài)學改變。模型組:炎性細胞浸潤，滑膜增生，形成絨毛狀突起，突向關(guān)節(jié)腔或浸入至軟骨或軟骨下骨質(zhì)，出現(xiàn)骨侵蝕，甚至出現(xiàn)多核巨細胞侵蝕骨質(zhì)。各治療組病理改變較模型組減輕，滑膜增生及骨侵蝕不明顯。LEF組（1.50±0.55）、TG+PNS組(1.33±0.52)病理積分低于模型組（2.33±0.51），差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，TG組(1.83±0.41)低于模型組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，其中TG+PNS

37、組病理積分最低，但與TG組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　8.TG、PNS及其配伍對大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織OPG、RANKL及骨組織MMP-3表達的影響
　　8.1 各組踝關(guān)節(jié)滑膜組織OPG表達的比較模型組(64.50±3.08)、TG組(75.00±3.63)、LEF組（84.17±3.19）、TG+PNS組(93.83±4.83)OPG灰度值均低于正常對照組（102.00±2.61）(P＜0.01); LEF組、TG

38、組、TG+PNS組OPG灰度值均高于模型組(P＜0.01);TG組OPG灰度值低于LEF組(P＜0.01)，TG+PNS組OPG灰度值高于LEF組(P＜0.01)，TG+PNS組OPG灰度值高于TG組(P＜0.01)，TG+PNS組OPG表達水平最低。
　　8.2 各組踝關(guān)節(jié)滑膜組織RANKL表達的比較模型組(70.00±3.35)、TG組（76.00±4.20）、LEF組（85.83±3.50）、TG+PNS組（94.50±4.

39、23）RANKL灰度值低于正常對照組（104.5±4.59）(P＜0.01); TG組RANKL灰度值高于模型組(P＜0.05)，LEF組、TG+PNS組高于模型組(P＜0.01); TG組RANKL灰度值低于LEF組(P＜0.01)，TG+PNS組RANKL灰度值高于LEF組(P＜0.01)，TG+PNS組RANKL灰度值高于TG組(P＜0.01)，TG+PNS組RANKL表達水平最低。
　　8.3 各組踝關(guān)節(jié)骨組織MMP-3表

40、達的比較模型組(82.83±4.07)、TG組(92.83±4.62)、LEF組(98.83±5.53)、TG+PNS組（106.00±4.73）MMP-3灰度值低于正常對照組（116.33±5.43）(P＜0.01);LEF組、TG組、TG+PNS組MMP-3灰度值高于模型組(P＜0.01);TG組MMP-3灰度值低于LEF組（P＜0.05），TG+PNS組MMP-3灰度值高于LEF組(P＜0.01)，TG+PNS組MMP-3灰度值高

41、于TG組(P＜0.01)，TG+PNS組MMP-3表達水平最低。
　　結(jié)論:
　　1.經(jīng)多種疼痛模型和關(guān)節(jié)炎模型研究證實，三七總皂苷具有明顯的鎮(zhèn)痛和抗炎效應(yīng)，且其藥效作用存在量-效關(guān)系。
　　2.雷公藤多苷對CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)炎指數(shù)和血清炎性細胞因子TNF-a、IL-6具有顯著抑制效應(yīng);三七總皂苷與雷公藤多苷配伍則顯示出在上述抗炎方面的增效作用。
　　3.雷公藤多苷配伍三七總皂苷可明顯下調(diào)CIA大鼠血清和滑