對(duì)一起聚集性發(fā)熱伴血小板減少綜合征的研究及該病病毒載量與病情相關(guān)性研究.pdf

1、發(fā)熱伴血小板減少綜合征(Severe Fever with Thrombocytopenia SyndromeSFTS)是我國(guó)在2009年首次發(fā)現(xiàn)的新發(fā)病毒性傳染病，病死率為高達(dá)30％。
　　本研究主要分出兩個(gè)部分:1.對(duì)一起聚集性發(fā)熱伴血小板減少綜合征病例進(jìn)行研究;2.對(duì)SFTSV載量與患者的病情進(jìn)行相關(guān)性研究。以進(jìn)一步了解SFTS的傳染機(jī)制，提高臨床醫(yī)師對(duì)本病的認(rèn)識(shí)，以對(duì)SFTS的臨床診治和防護(hù)做出指導(dǎo)。
　　第一部分

2、對(duì)一起聚集性發(fā)熱伴血小板減少病例綜合征病例的研究
　　目的:
　　1.研究可能導(dǎo)致發(fā)熱伴血小板減少綜合征(SFTS)人與人之間傳染的接觸方式及對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。
　　2.對(duì)SFTS隱性感染患者的傳染方式進(jìn)一步研究，以對(duì)SFTS的臨床診治和防護(hù)做出指導(dǎo)。
　　方法:
　　1.收集2014年7月山東省發(fā)生的一起疑似聚集性發(fā)熱板血小板減少綜合征的6個(gè)病例（病例A、病例B、病例C、病例D、病例E、病例F）的臨床資料和樣

3、本。并對(duì)患者及其密切接觸者或家屬進(jìn)行了居住環(huán)境、蜱蟲叮咬史、動(dòng)物接觸史、可能暴露途徑、是否采取了保護(hù)性措施等的流行病學(xué)調(diào)查。
　　2.從病例A的血涂片的刮取物提取總RNA用于巢式RT-PCR檢測(cè)。其余5例患者的血樣標(biāo)本采集離心后吸取血清上清液保存于-70℃直至用于提取病RNA。
　　3.使用TRIzol提取血清中的總RNA。
　　4.逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，分裝后保存于-80℃冰箱。
　　5.針對(duì)SFTSV基因組的

4、S、M、L片段分別設(shè)計(jì)兩對(duì)內(nèi)嵌式簡(jiǎn)并引物，進(jìn)行巢式RT-PCR，擴(kuò)增樣本中SFTSV的S、M、L的部分片段。
　　6.PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖膠電泳，用凝膠成像儀觀察并回收。
　　7.將特異性PCR片段純化測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過DNAStar軟件中的Seqman進(jìn)行拼接，通過序列比對(duì)分析進(jìn)一步確認(rèn)上述病例中SFTSV感染情況。
　　8.將確認(rèn)為SFTSV陽(yáng)性的血清樣本接種DH82細(xì)胞，收獲各代次培養(yǎng)上清離心棄去細(xì)胞碎片沉淀，分

5、裝至細(xì)胞凍存管至于-80℃凍存。
　　9.取各代次細(xì)胞培養(yǎng)上清，提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中病毒并分離擴(kuò)增。
　　10.PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的細(xì)胞上清1ml與DH82細(xì)胞孵育，用間接免疫熒光法(IFA)檢測(cè)細(xì)胞中病毒蛋白的表達(dá)。
　　11.對(duì)分離到的病毒進(jìn)行全基因序列的測(cè)定。
　　12.使用間接免疫熒光法(IFA)和細(xì)胞ELISA(cELISA)的方法對(duì)采集的血清樣本中抗SFTSV特

6、異性IgM及IgG的水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　13.使用抗體中和實(shí)驗(yàn)(MNA)對(duì)血清中中和抗體進(jìn)行測(cè)定。
　　14.將純化后的PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序。將測(cè)定的核酸序列用DNAstar軟件的SeqMan進(jìn)行拼接和校對(duì);利用DNAStar軟件包中的MegAlign軟件進(jìn)行序列比對(duì)，用Mega5.0中的最大相似度法構(gòu)建進(jìn)化樹，對(duì)各患者或密切接觸者血清樣本的PCR產(chǎn)物片段的核酸序列和分離到病毒的基因組序列進(jìn)行對(duì)比和進(jìn)化分析，從遺傳學(xué)的

7、角度揭示該聚集性SFTS病例的人與人之間傳染的可能。
　　結(jié)果:
　　1.病例A在入院第二天死于多臟器功能障礙;給于病例B支持治療、輸注血小板、皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子等后，治療無效病情惡化，于發(fā)病第10天死亡;病例C給于對(duì)癥支持治療后，病情好轉(zhuǎn)，于發(fā)病14天痊愈出院;密切病例D、E和F接觸患者后無一發(fā)病。病例A、B、C均有發(fā)熱伴血小板減少，其中病例A和病例B還伴有白細(xì)胞減少。
　　2.病例B和病例C都直接接觸了病例

8、A的血液和皮膚黏膜并污染了衣物，病例A整個(gè)過程中和事后未采取任何保護(hù)措施，而且事后繼續(xù)穿沾了血液的衣物照顧病例A，而病例C事后把他沾了血液的衣服扔了，然后洗了雙手，洗了個(gè)澡。病例D接觸過C，病例E接觸過B，病例F均接觸過B和C。病例D、E、F均接觸過患者的皮膚、黏膜和體液，病例D和病例E未采取任何保護(hù)措施，而病例F帶了口罩而且后來洗手了?？赏茢嗑奂圆±蠸FTSV可能的傳播路線是從原發(fā)患者（病例A）至繼發(fā)患者（病例B和病例C），然后是

9、從病例B至病例E和病例F，病例C至病例D和病例F。
　　3.病例A的血涂片及病例B的血樣中檢測(cè)到SFTSV的RNAS片段(1160-1513nt)及L片段(589-806nt)，但是在病例C的血樣中未檢測(cè)到上述片段。病例D的血樣中未檢測(cè)到SFTSV的RNA片段，但是在病例E和病例F的血樣中檢測(cè)到SFTSV RNA的L片段。
　　4.通過cELISA我們可以檢測(cè)到病例B、病例C、病例D、病例E及病例F的血樣中有不同滴度的IgM

10、水平;而通過IFA，我們只檢測(cè)到病例E和病例F的IgM陽(yáng)性。
　　5.通過cELISA我們可以檢測(cè)到病例B和病例C有低滴度的IgG;而通過IFA檢測(cè)到病例B的血樣IgG陽(yáng)性。
　　6.MNA顯示從病例B血樣中分離到的病毒可以和病例E和病例F的血樣起反應(yīng)，發(fā)生中和作用。
　　7.病例B的PCR產(chǎn)物S和L片段（分別為354bp和218bp）的序列和分離出病毒序列完全一致。病例A的PCR產(chǎn)物S片段(199bp)有99.5％的

11、核酸序列與病例B的一致，而且病例A的PCR產(chǎn)物L(fēng)片段(218bp)與病例B的完全一致。
　　8.系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示:分離出的病毒的S序列與病例A和病例B的PCR產(chǎn)物序列聚集在一起。此外，病例E和病例F的PCR產(chǎn)物L(fēng)片段與病例A及病例B的及分離到的病毒序列完全一致。因而我們考慮病例A、B、E、F和分離到的病毒有共同的起源。
　　結(jié)論:
　　1.SFTSV因?yàn)檠罕┞稄脑l(fā)患者傳染至繼發(fā)患者。
　　2.3位SFTSV隱

12、性感染者為近期的感染，考慮是因接觸繼發(fā)患者的體液及粘膜所致。
　　第二部分 發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒載量與病情相關(guān)性研究
　　目的:
　　1.探討發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV)在人體內(nèi)存在的時(shí)限。
　　2.研究SFTSV病毒載量與病情的嚴(yán)重程度及預(yù)后的相關(guān)性。
　　方法:
　　1.自2015年5月至2016年10月，在威海市中心醫(yī)院感染性疾病科收集住院SFTS患者血樣標(biāo)本125例。標(biāo)本采集

13、離心后吸取血清上清液保存于-70℃直至用于提取病毒RNA。并對(duì)其中46例患者入院期間連續(xù)采取血清。
　　2.收集臨床資料包括有無合并癥。
　　3.收集患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo):白細(xì)胞、血小板、肝功、腎功、心肌酶、電解質(zhì)、血凝常規(guī)。
　　4.提取血樣標(biāo)本中的病毒RNA，提取后收集到無菌EP管中待用。
　　5.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)提取的病毒RNA檢測(cè)SFTSV載量。
　　6.其中46例進(jìn)行SFTSV RNA的

14、動(dòng)態(tài)分析，觀察SFTSVRNA在人體內(nèi)存在的時(shí)限及與病情的相關(guān)性。
　　7.對(duì)比分析兩組并發(fā)癥發(fā)的發(fā)生率和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的差異，及與預(yù)后的相關(guān)性。
　　8.使用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.一般資料:125例患者男64例，女61例，平均年齡（59.0±3.6）歲，治愈101例，死亡24例。
　　2.兩組SFTSV RNA定量比較:低病毒載量組81例，SFTSV RNA載量為(3.08

15、±1.01)拷貝/mL，高病毒載量組有44例，SFTSV RNA載量為(5.69±0.99)拷貝/mL，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.78，P＜0.05）。
　　3.對(duì)46例患者進(jìn)行SFTSV的動(dòng)態(tài)檢測(cè)，顯示發(fā)病1周后大多數(shù)患者的病毒量開始下降，至發(fā)病23天后，均轉(zhuǎn)為陰性。
　　4.兩組神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、出血傾向、嚴(yán)重心肌損害及肺炎的發(fā)生率分別為4.76％、0％、0％、2.47％和90.9％、40.9％、70.5％、68.

16、2％。
　　5.125例患者WBC總數(shù)均減少。
　　6.125例患者PLT總數(shù)均減少，為(10～88)×109/L，兩組PLT總數(shù)分別為(58±21)×109/L和(38±22)×109/L，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.869，P＜0.05)。
　　7.兩組患者肝功、腎功能比較:1.兩組的ALT、BUN、Cr、UA比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;2.兩組的AST、GGT比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　8.兩組的肌酸激酶、

17、肌酸激酶同工酶、乳酸脫氫酶和羥丁酸脫氫比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
　　9.兩組的電解質(zhì)及血糖比較:1.兩組的血鈉、血鈣和血糖比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z/t=2.666、2.612、-2.321，均P＜0.05）;2.兩組的血鉀和血氯比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z/t=1.498、0.287，均P＞0.05)。
　　10.兩組血凝四項(xiàng)指標(biāo)比較:1.兩組的活化部分凝血酶時(shí)間(APTT)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.623，P＜0.01）