低剪切應(yīng)力對(duì)小鼠腹主動(dòng)脈重建的影響及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、背景和目的：
　　 動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)導(dǎo)致的心腦血管疾病是危害人類(lèi)健康的主要原因之一,AS的致病機(jī)理一直是心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),粥樣斑塊常出現(xiàn)于動(dòng)脈特定部位(血流低速區(qū),回流區(qū)等),最主要的脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)、血栓形成學(xué)說(shuō)、單克隆學(xué)說(shuō)和損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)等并不能完全解釋 AS發(fā)生的局灶性(localization of atherosclerosis),而血流動(dòng)力學(xué)因素在 AS發(fā)生條件中具有主要的作用,血流

2、動(dòng)力學(xué)成因理論為認(rèn)識(shí)AS的局灶性和發(fā)病機(jī)制提供了新的視角,與作用時(shí)間相關(guān)的血流剪切應(yīng)力,尤其是低剪切應(yīng)力(low shear stress)大小、方向的改變,可通過(guò)引起血管重建(vascular remodeling)和內(nèi)皮黏附分子(endothelial adhesion molecule)表達(dá)的上調(diào),導(dǎo)致內(nèi)皮炎癥的發(fā)生,從而在AS的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。
　　 正常范圍的血流剪切應(yīng)力對(duì)于維持血管穩(wěn)態(tài)包括抗血栓形成、屏障功

3、能和血管本身的動(dòng)態(tài)平衡有重要的調(diào)節(jié)作用,血流剪切應(yīng)力改變后血管穩(wěn)定性受到破壞,將致使血管重建的發(fā)生。血管重建是指為適應(yīng)內(nèi)、外環(huán)境(尤其是力學(xué)環(huán)境)的變化而發(fā)生的血管形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的一系列適應(yīng)性改變,包括早期組分不變的適應(yīng)性重排和晚期結(jié)構(gòu)與功能改變的病理性重建,而病理性的血管重建是動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和血管再狹窄等常見(jiàn)心腦血管病變共同的病理基礎(chǔ),但是造成血管重建的細(xì)胞分子生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。剪切力學(xué)說(shuō)認(rèn)為,均勻的層流剪切力可選擇性地誘導(dǎo)內(nèi)

4、皮抗動(dòng)脈粥樣硬化基因的表達(dá),作用于局部以抵消全身危險(xiǎn)因素的有害作用,當(dāng)剪切力的性質(zhì)和大小出現(xiàn)異常,內(nèi)皮分泌抗動(dòng)脈粥樣硬化分子減少,促炎因子表達(dá)增加,從而激活相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與誘導(dǎo)炎癥進(jìn)展,導(dǎo)致血管重建和AS的發(fā)生、發(fā)展。
　　 炎癥細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和跨壁轉(zhuǎn)移是AS形成機(jī)制的第一步,正常情況下白細(xì)胞很難與內(nèi)皮黏附,只有當(dāng)外來(lái)因素如細(xì)胞因子、氧化脂蛋白、切應(yīng)力等與內(nèi)皮相互作用后使內(nèi)皮表面不表達(dá)或低表達(dá)的粘附分子如:細(xì)胞間粘

5、附分子-1(ICAM-1)、VCAM-1、P-選擇素和 E-選擇素等表達(dá)增加,有助于各種白細(xì)胞的粘附。其中 P-選擇素(P-selectin)在動(dòng)脈病變?cè)缙趯?duì)活化的血小板、白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的初次黏附起決定性作用,是啟動(dòng)內(nèi)皮炎癥反應(yīng)并維持炎癥狀態(tài)的關(guān)鍵成分,正常的內(nèi)皮細(xì)胞僅表達(dá)極少量無(wú)介導(dǎo)白細(xì)胞活性的 P-選擇素,在血流低切應(yīng)力等因素持續(xù)作用下,通過(guò)進(jìn)一步的脂質(zhì)堆積、內(nèi)皮功能改變等引起炎癥刺激內(nèi)皮,內(nèi)皮才表達(dá)具有介導(dǎo)炎癥細(xì)胞活性的 P-選

6、擇素；而血管內(nèi)皮黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)主要在后續(xù)的白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的緊密黏附及介導(dǎo)白細(xì)胞滲出、遷移過(guò)程中起作用,正常條件下內(nèi)皮不表達(dá) VCAM-1,理化因素(如血流剪切應(yīng)力異常等)刺激損傷內(nèi)皮后表達(dá)增加,并有延遲表達(dá)或持續(xù)長(zhǎng)久的特點(diǎn),可促進(jìn)對(duì)內(nèi)皮的損傷,亦是維持內(nèi)皮炎癥狀態(tài)的關(guān)鍵成分之一。因此,如果血流剪切應(yīng)力異常是 AS發(fā)生的始動(dòng)因素,內(nèi)皮表達(dá)的 P-選擇素、V

7、CAM-1等粘附分子則可能是AS形成的樞紐之一。
　　 如能盡早檢測(cè)出反映血流動(dòng)力學(xué)變化的綜合指標(biāo),深入研究剪切力變化早期引起的血管生物學(xué)效應(yīng)以及其與 AS形成之間的關(guān)系和作用機(jī)制,對(duì)進(jìn)一步揭示AS的本質(zhì)、探索防治AS的方法有重要的理論和實(shí)際意義。
　　 目前已有研究發(fā)現(xiàn),大小、形態(tài)異常的血流剪切應(yīng)力作用可通過(guò)影響多種炎癥分子的表達(dá)而導(dǎo)致不同性質(zhì)的粥樣斑塊形成,但有關(guān)血流動(dòng)力學(xué)變化早期,低剪切應(yīng)力作用對(duì)動(dòng)脈病變?cè)缙谘苤?/p>

8、建的影響及其相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。為此,本研究擬通過(guò)制備小鼠腹主動(dòng)脈局部狹窄模型,在同一段平直血管上建立近似層流和振蕩流的低剪切應(yīng)力區(qū)域,觀察血流動(dòng)力學(xué)改變短時(shí)間內(nèi)不同形態(tài)低剪切應(yīng)力對(duì)動(dòng)脈重建和內(nèi)皮 P-選擇素表達(dá)的影響,并在此基礎(chǔ)上較長(zhǎng)時(shí)間觀察近似層流低剪切應(yīng)力作用下動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)與內(nèi)皮 P-選擇素、VCAM-1等黏附分子表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化,以進(jìn)一步了解低剪切應(yīng)力引起的血管生物學(xué)效應(yīng)與早期 AS發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系及其作用機(jī)制。

9、r>　　 材料和方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:①短時(shí)間觀察組:20只昆明小白鼠,性別不限,體重(18.0～2.0)g,隨機(jī)分為短時(shí)間對(duì)照組和短時(shí)間觀察組(狹窄1h,4h,24h組),每組5只；②長(zhǎng)時(shí)間觀察組:25只昆明小白鼠,性別不限,體重(18.0～2.0)g,隨機(jī)分為長(zhǎng)時(shí)間對(duì)照組和長(zhǎng)時(shí)間觀察組(狹窄1d,7d,14d,28d組),每組5只。
　　 2、腹主動(dòng)脈局部狹窄模型制備:狹窄組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后,

10、仰臥位固定四肢,腹部去毛后75％酒精消毒皮膚,取正中線剪開(kāi)皮膚及腹壁,移開(kāi)腸腔并用溫鹽水紗布保濕,分離左腎動(dòng)脈分支與髂動(dòng)脈分叉之間腹主動(dòng)脈,平直段放置內(nèi)徑0.1mm動(dòng)脈銀夾,小心回置腸腔,無(wú)菌縫合切口關(guān)閉腹腔,對(duì)照組組小鼠只分離,未放置銀夾。對(duì)照組于術(shù)后即刻,短時(shí)間組于術(shù)后1、4、24h,長(zhǎng)時(shí)間組于術(shù)后1、7、14、28d行彩超檢查,再?gòu)脑锌陂_(kāi)腹,從心臟采血1ml置抗凝管待測(cè)血粘度,暴露腹主動(dòng)脈,用冰丙酮灌注固定后,分別取出短時(shí)間組銀

11、央近心端及遠(yuǎn)心端、長(zhǎng)時(shí)間組銀夾近心端及對(duì)照組腹主動(dòng)脈組織各約5mm,液氮速凍待冰凍切片染色觀察。
　　 3、血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定:將超聲高頻探頭置于小鼠腹部,分別測(cè)量短時(shí)間組銀夾近心端及遠(yuǎn)心端、長(zhǎng)時(shí)間組銀夾近心端5mm內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù):舒張末期血管內(nèi)徑(D)、最大血流速度(V m),每只小鼠測(cè)10次最后取平均值?？鼓?h內(nèi)用毛細(xì)血管黏度計(jì)測(cè)量血液粘度(η)(低切)。根據(jù)公式τm=η×4×Vm/D計(jì)算血流剪切應(yīng)力(τm)。

12、>　　 4、動(dòng)脈HE染色與形態(tài)學(xué)分析:采用冰凍切片常規(guī)HE染色方法,5μm不連續(xù)切片,4℃冰丙酮固定30 s稍水洗,蘇木素染色40s~60s后水洗5s~10s(必要時(shí)1％鹽酸酒精分化溫水返藍(lán)),伊紅滴后速洗,梯度酒精脫水、二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片,每條動(dòng)脈組織隨機(jī)抽取2張切片,光鏡下觀察血管壁形態(tài)結(jié)構(gòu),AutoCad圖像分析軟件測(cè)量血管內(nèi)徑與壁厚。
　　 5、內(nèi)皮粘附分子免疫組織化學(xué)染色與量化分析:短時(shí)間組檢測(cè)內(nèi)皮P-選擇素,

13、長(zhǎng)時(shí)間組與對(duì)照組檢測(cè)內(nèi)皮P-選擇素與VCAM-1。各組在相同條件下采用二步法檢測(cè),5μm冰凍切片置室溫30min,4℃冰丙酮固定10 min(PBS洗5 min×3次),加過(guò)氧化氫室溫10 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性(PBS洗5 min×3次),5％～10％山羊血清封閉10min傾去勿洗,滴加一抗置4℃冰箱過(guò)夜后室溫復(fù)溫30min(PBS洗5 min×3次),加二抗工作液室溫30min,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,脫水透明后封片觀察并攝

14、片。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)抽取2張不連續(xù)切片,用IPP圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行陽(yáng)性染色吸光度的量化分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示:各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物腹主動(dòng)脈內(nèi)徑(D)和血液黏度(η)之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；狹窄組銀夾近心端血流近似層流,其最大血流速度(V m)和血流剪切應(yīng)力(τm)較對(duì)照組減低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,銀夾遠(yuǎn)心端血流形成了振蕩性渦流區(qū),血流速度極低,超聲的分辨率未能檢測(cè)到具體波形,剪切應(yīng)力趨向于0。提示成功制備低

15、剪切應(yīng)力模型,并在同一段血管上形成了不同形態(tài)的低剪切應(yīng)力血流區(qū)。
　　 2、腹主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)觀察與分析結(jié)果顯示:對(duì)照組血管內(nèi)皮光整,長(zhǎng)梭形平滑肌細(xì)胞排列均勻；狹窄組動(dòng)脈管壁不均勻增厚,內(nèi)中膜增厚凸向管腔,可見(jiàn)脫落細(xì)胞核,平滑肌細(xì)胞增生明顯,細(xì)胞核縮短呈層多形狀,且隨狹窄時(shí)間的增加內(nèi)皮與平滑肌細(xì)胞核形態(tài)與分布逐漸紊亂,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸增多。與對(duì)照組比較,短時(shí)間組近心端及遠(yuǎn)心端內(nèi)-中膜均顯著增厚,且以近心端為甚；長(zhǎng)時(shí)間組狹窄1d已

16、有動(dòng)脈壁增厚、內(nèi)徑減少、壁厚內(nèi)徑比增大,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),狹窄7、14、28d組動(dòng)脈內(nèi)徑逐漸減小,動(dòng)脈壁增厚與壁厚內(nèi)徑比進(jìn)一步增大。提示不同形態(tài)的低剪切應(yīng)力導(dǎo)致的病變程度是不同的,所引起的血管生物學(xué)效應(yīng)與作用時(shí)間和強(qiáng)度有關(guān)。
　　 3、內(nèi)皮 P-選擇素與 VCAM-1的表達(dá)結(jié)果顯示:對(duì)照組血管內(nèi)皮無(wú)明顯 P-選擇素與 VCAM-1表達(dá)；短時(shí)間組近心端及遠(yuǎn)心端內(nèi)皮均有明顯 P-選擇素表達(dá),而且近心端內(nèi)皮染色更為顯著；長(zhǎng)時(shí)間組近心端內(nèi)

17、皮 P-選擇素的表達(dá)在1d開(kāi)始明顯上調(diào)并持續(xù)至28d,但隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)在7d達(dá)高峰后呈下降趨勢(shì),而內(nèi)皮 VCAM-1表達(dá)在7d才開(kāi)始顯著上調(diào),14d達(dá)高峰并持續(xù)保持高水平表達(dá)。提示各種黏附分子對(duì)血流剪切應(yīng)力的敏感性可能不同。
　　 結(jié)論：
　　 1、血流低剪切力較短時(shí)間內(nèi)即可引起動(dòng)脈重建和上調(diào)內(nèi)皮 P-選擇素表達(dá)；
　　 2、不同形態(tài)低剪切力導(dǎo)致的動(dòng)脈病變不同,近似層流較振蕩流引起的動(dòng)脈病理改變更為顯著；