溫控型啟動子在酶的重組表達(dá)中的應(yīng)用.pdf

1、分類號：Q936密繳：(秘密、機(jī)密、絕密)學(xué)校代碼：10057研究生學(xué)號：12812509溫控型啟動子在酶的重組表達(dá)中的應(yīng)用TheApplicationofTemp—regulatedPromotertecombinantEnzyme專業(yè)名稱：微生物與生化藥學(xué)(理)指導(dǎo)教師姓名：黎明副教授研究生姓名：李楊申請學(xué)位類別：理學(xué)碩士論文提交日期：2015年5月論文課題來源：國家“863”計劃學(xué)位授予單位：天津科技大學(xué)摘要控制基因轉(zhuǎn)錄與結(jié)合的關(guān)

2、鍵部件是基因上游序列，即啟動子。通過改變特定基因的啟動子序列即可達(dá)到改變特定基因轉(zhuǎn)錄方式與特征，并由此探討基因轉(zhuǎn)化方式變化的細(xì)胞相關(guān)生理特征的可能改變，進(jìn)而探索新的基因功能呈現(xiàn)與可能應(yīng)用。為此，本研究通過基因替換方式，特定改變基因的啟動子序列，通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)改變后的突變株相關(guān)生理屬性的可能改變，探討未來基因表達(dá)調(diào)控的新型模式。膜結(jié)合型的吡咯喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶(mPQQGDH，ECl152)是一種重要的氧化還原酶，因其在血糖診斷及葡萄

3、糖傳感器中的重要應(yīng)用而受到廣泛的關(guān)注。運(yùn)用基因定點(diǎn)替換方式，對大腸桿菌的膜結(jié)合型的吡咯喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶(mPQQGDH)編碼基因的啟動子序列實(shí)施更換，成功獲得突變體EscherichiacoliB0013120／pGCd：：KmPLPR，突變體的mPQQGDH表達(dá)受控于溫度誘導(dǎo)型啟動子PLPR，重組菌的酶活比出發(fā)菌株提高了212％。同時對其發(fā)酵條件和誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到的結(jié)果為重組酶的最適孵育溫度為25℃，最適pH為60，誘

4、導(dǎo)前菌體密度為氏oo=16，最佳誘導(dǎo)溫度為42℃，最佳誘導(dǎo)時間為4h。賴氨酸脫羧酶是生物法合成戊二胺的關(guān)鍵酶。運(yùn)用上述相似的方法，將誘導(dǎo)型賴氨酸脫羧酶編碼基因的啟動子序列用溫度誘導(dǎo)型啟動子PLPR進(jìn)行了成功的替換，獲得了相應(yīng)的突變體EcoliB0013120／pLDC：：pLpelBs，并添加信號肽使胞內(nèi)酶賴氨酸脫羧酶分泌到細(xì)胞周質(zhì)空間表達(dá)。結(jié)果表明：重組菌株轉(zhuǎn)化賴氨酸生成戊二胺的效率略高于出發(fā)菌株，但誘導(dǎo)過程中不用添加誘導(dǎo)劑，通過溫度