異檸檬酸脫氫酶IDH突變體抑制劑發(fā)現(xiàn)研究.pdf

1、目的：腫瘤細胞代謝通路異常是新近備受關注的的腫瘤細胞不同于正常細胞的重大特征之一。靶向腫瘤代謝，特別是在腫瘤細胞中存在突變的代謝酶基因，成為目前新興的抗腫瘤策略。異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）是參與催化細胞三羧酸循環(huán)的關鍵限速酶，被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織中發(fā)生異常突變，是迄今發(fā)現(xiàn)的在腫瘤中基因突變最為頻繁的代謝酶，特別是其亞型IDH1的R132位突變更為常見，在多種實體瘤中廣泛發(fā)生。最新研究表明，

2、突變的IDH1獲得新的功能，可利用代謝中間產(chǎn)物α-酮戊二酸(α-KG)作為底物催化生成 D-2-羥基戊二酸（2-HG），繼而通過影響組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，引發(fā)組蛋白甲基化水平改變，從而改變轉(zhuǎn)錄調(diào)控而促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。當前，針對IDH1 R132H突變的分子靶向抗腫瘤藥物研發(fā)已經(jīng)成為腫瘤代謝領域最具潛質(zhì)的研究方向，但現(xiàn)有抑制劑的研究尚處于研發(fā)早期，且敏感群體不明，具有極大的研究空間。本論文旨在特異針對IDH1 R132H，建立系統(tǒng)的抑制劑

3、發(fā)現(xiàn)研究體系，并在此基礎上，發(fā)現(xiàn)活性化合物。進一步，發(fā)現(xiàn)敏感群體，擴大抑制劑適應癥范圍，探索更加有效的抗腫瘤策略。
　　方法：本論文旨在建立集分子、細胞、動物于一體，兼顧靶向性、選擇性、綜合代謝產(chǎn)物變化和抗腫瘤活性的IDH突變抑制劑系統(tǒng)篩選平臺；在此基礎上，結合化合物庫篩選及基于現(xiàn)有活性化合物的定向設計，發(fā)現(xiàn)能有效抑制 IDH1 R132H突變活性的先導化合物，并對獲得化合物進行初步的抗腫瘤活性和成藥性評價。分子水平篩選體系旨在建

4、立基于重組蛋白的酶促反應；細胞水平將外源表達IDH1 R132H的U87MG腦膠質(zhì)瘤突變細胞株模型構建及內(nèi)源性含IDH1 R132C突變的HT1080纖維肉瘤細胞驗證相結合，運用超高效液相色譜法檢測細胞內(nèi)2-HG生成量變化來評價細胞代謝特性的改變，使用克隆形成、軟瓊脂集落形成實驗及磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B, SRB)等方法評價對腫瘤細胞增殖能力的影響；動物水平旨在建立基于依賴細胞株的SCID鼠皮下移植瘤模型，并在該

5、模型上通過關注給藥后瘤體積及瘤內(nèi)2-HG含量測定等評價化合物的體內(nèi)抗腫瘤活性。
　　結果：本論文成功構建了IDH1抑制劑的發(fā)現(xiàn)平臺，構建了基于酶活反應的分子水平篩選體系；構建了腦膠質(zhì)瘤細胞U87MG外源表達突變質(zhì)粒構建的IDH1R132H突變細胞株，驗證了內(nèi)源含有R132C的HT1080細胞模型；建立了HT1080皮下移植瘤模型。通過篩選186個定向設計的化合物，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了分子和細胞水平均優(yōu)于現(xiàn)有化合物的新IDH1抑制劑，并對化合