染料木黃酮抑制人巨細(xì)胞病毒即刻早期蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　1．探究人巨細(xì)胞病毒（Human Cytomegalovirous，HCMV）感染人星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocytes，AS)即刻早期蛋白IE72表達(dá)變化。
　　2．通過檢測染料木黃酮（Genistein，Gen）抑制HCMV感染AS引起的即刻早期蛋白IE72及其mRNA的表達(dá)變化，以此探討Gen對HCMV感染AS的影響。再檢測IE72基因啟動(dòng)子區(qū)域(major immediate early promoter,

2、MIEP）組蛋白乙酰化水平，進(jìn)一步探討Genistein抑制人星形膠質(zhì)細(xì)胞HCMV感染的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　方法：
　　1．純化新取材的原代AS，免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescencetechnique）標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白—膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。
　　2.MTT檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞活性。
　　3.分別用Real-ti

3、me PCR和Western blot檢測IE72mRNA和蛋白的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)分為HCMV組、Gen組、用含40μM Gen的2％ DMEM/F12培養(yǎng)液預(yù)處理細(xì)胞4h后，以MIO=5的HCMV感染AS組（Gen+HCMV組）、細(xì)胞培養(yǎng)至基本融合后更換含2%FBS的D/F12維持培養(yǎng)，以MIO=5的HCMV感染AS，置恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h后棄去培養(yǎng)液，更換含40μM Gen的2% DMEM/F12培養(yǎng)液組（HCMV+Gen組）和對照

4、組。
　　4.染色質(zhì)免疫共沉淀法（ChIP）檢測HCMV組、Gen+HCMV組、HCMV+Gen組和對照組的主要即刻早期基因啟動(dòng)子區(qū)域（MIEP）組蛋白H3乙?；健?br>　　結(jié)果：
　　1.Cy3標(biāo)記的抗GFAP顯示95%以上細(xì)胞為AS。
　　2.MTT顯示:40μM Gen+HCMV組24 h、48 h、72 h的吸光值顯著高于HCMV組（P<0.05）；病毒形態(tài)感染48h后，HCMV組細(xì)胞有明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)

5、（CPE），40μMGen+HCMV組細(xì)胞狀態(tài)良好。
　　3.RT-qPCR結(jié)果顯示:感染24h、48h、72 h和96h時(shí)HCMV+Gen組及Gen+HCMV組IE72的mRNA表達(dá)明顯低于HCMV組（P<0.05）。
　　4.Western blot結(jié)果顯示:感染HCMV+Gen組及Gen+HCMV組細(xì)胞的IE72蛋白表達(dá)都明顯低于HCMV組（P<0.05）。
　　5.ChIP法提取MIEP組蛋白H3乙酰化的結(jié)果顯