活細胞氧化還原狀態(tài)的光學(xué)成像動態(tài)檢測.pdf

1、細胞的氧化還原狀態(tài)在細胞的各種生命活動中扮演著重要的角色。本文利用一種GFP的突變體：氧化還原敏感性GFP（reduction-oxidation-sensitive GFP，roGFP1），對順鉑（cisplatin）誘導(dǎo)的細胞凋亡過程中線粒體的氧化還原電勢變化動力學(xué)過程，進行動態(tài)光學(xué)成像檢測，并初步探討了多光子激發(fā)對細胞氧化還原狀態(tài)可能產(chǎn)生的影響，以及由多光子激發(fā)導(dǎo)致的熒光蛋白光轉(zhuǎn)換現(xiàn)象在監(jiān)測線粒體運動中的應(yīng)用。本研究主要實驗結(jié)果和

2、結(jié)論如下：
　　 ⑴優(yōu)化基于roGFP1的細胞氧化還原比率成像條件：對Olympus FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡的成像參數(shù)進行了優(yōu)化，并分析比較了各種參數(shù)（如PMT、pinhole等）對roGFP1在405nm和488nm雙波長激發(fā)下的熒光比率值（R405/488）的影響。研究結(jié)果證實，細胞內(nèi)roGFP1蛋白質(zhì)的表達量對其R405/488值影響極小，roGFP1是一種穩(wěn)定的雙吸收波長比率型熒光探針。
　　 ⑵用熒光

3、比率成像檢測roGFP1對外源性氧化還原劑的反應(yīng)靈敏度：利用外源性氧化劑H2O2和還原劑DTT，對roGFP1的R405/488值變化動力學(xué)過程進行了實時監(jiān)測。在我們的成像系統(tǒng)中，roGFP1能對最低0.2 mM的H2O2做出反應(yīng)；探針的R405/488值變化有很好的可逆性，即roGFP1能夠動態(tài)可逆地反映細胞氧化還原狀態(tài)。
　　 ⑶通過順鉑(cisplatin)誘導(dǎo)Hela細胞凋亡，用roGFP1動態(tài)監(jiān)測線粒體氧化還原電勢變化

4、。結(jié)果表明，凋亡過程中，線粒體的氧化還原電勢發(fā)生了劇烈的變化；作為細胞的應(yīng)激反應(yīng)，細胞內(nèi)存在某種機制能夠?qū)咕€粒體中電勢的升高（如谷胱甘肽等還原小分子）。
　　 ⑷利用roGFP1探針初步探討多光子激發(fā)是否能引起由于光致ROS增加而導(dǎo)致的線粒體的氧化還原變化。實驗中我們卻意外發(fā)現(xiàn)多光子能引起roGFP1光譜性質(zhì)的顯著改變。利用多光子激發(fā)誘導(dǎo)的roGFP1光譜轉(zhuǎn)換特征，我們初步嘗試了用于研究線粒體的運動。
　　 綜上所述，