輻射敏感基因作為潛在生物劑量計的實驗研究.pdf

1、電離輻射能夠?qū)е翫NA斷裂引起基因表達發(fā)生變化，推測電離輻射敏感基因可能發(fā)展成為輻射損傷生物標(biāo)志物，用于生物劑量的估算?，F(xiàn)有的生物劑量計存在耗時耗力的問題，不能滿足大批量受照人群的快速檢測，因此需要建立一種快速、高通量的生物劑量估算方法應(yīng)對大批量受照人群的劑量估算。本文將在前期基因芯片研究的基礎(chǔ)上，對篩選出的輻射后差異表達、具有一定的劑量依賴性、本底值相對均一的TRIAP1、RPS27L、AEN、C12orf5、SPIB5個輻射誘導(dǎo)上調(diào)

2、基因和TCL1A1個輻射誘導(dǎo)下調(diào)基因，利用實時熒光定量PCR進行深入研究，探索這些基因作為新型分子輻射生物劑量計的可行性。
　　目的:
　　研究輻射敏感基因照射后的時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)關(guān)系以及健康人的本底水平，探討其作為輻射損傷早期生物標(biāo)志物應(yīng)用于生物劑量估算的可行性。
　　方法:
　　1通過對TRIAP1、RPS27L、AEN、C12orf5、TCL1A、SPIB6個輻射敏感基因和β-actin1個內(nèi)參基因的引物

3、特異性檢測、探針非特異性排除、反應(yīng)溫度的優(yōu)化、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，建立實時熒光定量PCR檢測方法。
　　2采用不同劑量(0Gy、0.5Gy、1Gy、2Gy、4Gy、6Gy、10Gy)的60Coγ射線照射正常人外周血，在照射后培養(yǎng)不同時間(0h、2h、4h、8h、12h、24h)收集，提取全血總RNA，采用實時熒光定量PCR的TaqMan探針兩步法檢測照射后TRIAP1、RPS27L、AEN、C12orf5、TCL1A

4、、SPIB6個輻射敏感基因的mRNA表達水平，觀察其隨受照劑量和培養(yǎng)時間的表達變化，篩選具有輻射損傷生物標(biāo)志物潛力的基因。
　　3采集29名健康志愿者的外周血進行TRIAP1、RPS27L、AEN3個基因本底水平的分析（男性15名，女性14名；年齡組分別為21-30歲組10人，31-40歲組10人，41-50歲組9人），提取全血總RNA，采用實時熒光定量PCR的TaqMan探針兩步法檢測輻射敏感基因mRNA的本底表達水平。

5、　　4采用6-8周齡體重18-22g的雄性C57BL/6小鼠，進行不同劑量(2Gy、8Gy)的γ射線整體照射，未照射樣0Gy為對照組；照射后不同時間點(4h、8h、12h、24h、48h、72h)采集血樣提取總RNA，利用實時熒光定量PCR的TaqMan探針兩步法檢測照射后TRIAP1、RPS27L、AEN3個輻射敏感基因和18S RNA1個內(nèi)參基因mRNA隨劑量和時間的表達變化，研究輻射敏感基因在小鼠的整體照射后的表達效應(yīng)。
　

6、　結(jié)果:
　　1通過對6個輻射敏感基因和β-actin內(nèi)參基因引物特異性的檢測、探針非特異性排除、反應(yīng)溫度的優(yōu)化、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，建立了實時熒光定量PCR的檢測方法。
　　2在對外周血進行不同劑量照射培養(yǎng)不同時間后，與對照組相比，TRIAP1基因在2h、4h開始增加，8h達到峰值10.44，12h、24h略有下降，在8h、12h和24h呈現(xiàn)出較好的劑量依賴關(guān)系；RPS27L在2h各劑量下無明顯增加，4h開始

7、逐漸增加，8h達到峰值9.97，12h和24h下降至與4h相近的水平，在4h、8h、12h和24h呈現(xiàn)出較好的劑量依賴關(guān)系；AEN基因在2h開始增加，4h、8h和12h持續(xù)增加并呈現(xiàn)出一定的劑量飽和效應(yīng)，24h開始下降但仍高于本底；C12orf5基因在2h各劑量點下均無顯著增加，4h開始增加明顯，8h、12h和24h表達變化水平相近呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性；TCL1A基因在2h各劑量點下均無顯著減少，在4h、8h、12h和24h略有減少但

8、未呈現(xiàn)出明顯劑量依賴關(guān)系；SPIB基因在4h、8h表達水平升高但無顯著性差異，在2h、12h和24h在各劑量點下幾乎沒有響應(yīng)。
　　3不同劑量照射后，TRIAP1基因在8h、12h和24h擬合0.5-10Gy的劑量效應(yīng)曲線分別為y=2.663ln(x)+4.3668, R2=0.9969;y=1.6162ln(x)+3.6017, R2=0.9799;y=1.0839ln(x)+2.9733, R2=0.9562;RPS27L基因

9、在4h,8h,12h和24h0.5-10Gy的劑量效應(yīng)擬合曲線分別為y=0.7608ln(x)+2.141, R2=0.9594;y=2.1686ln(x)+4.3925,R2=0.9636;y=0.8334ln(x)+2.4676, R2=0.9684;y=0.4786ln(x)+2.023, R2=0.9204;AEN基因在2h,4h,8h進行0.5-6Gy劑量范圍的劑量效應(yīng)擬合曲線分別為y=1.31ln(x)+2.1332, R2

10、=0.9326;y=2.3864ln(x)+5.2762, R2=0.9913;y=4.6111ln(x)+8.4048, R2=0.9829,在12h和24h進行0.5Gy-4Gy劑量范圍的劑量效應(yīng)擬合曲線分別為y=2.5651ln(x)+5.3049, R2=0.9715;y=1.8254ln(x)+4.7758, R2=0.9686。所有曲線方程的R2均大于0.92，說明劑量效應(yīng)關(guān)系顯著。
　　4通過29個健康人本底水平檢測

11、后的結(jié)果得出， TRIAP1基因本底值是0.170±0.031，波動范圍0.101-0.248，變異系數(shù)18.086％；RPS27L基因的平均值為1.450±0.183，波動范圍是1.085-1.775，變異系數(shù)是12.641%；AEN基因的平均值為0.056±0.010，波動范圍是0.041-0.075，變異系數(shù)是18.001%。3個基因的變異系數(shù)均在20%以內(nèi)，波動范圍小且相對均一。分別對 TRIAP1、RPS27L和 AEN基因進

12、行年齡和性別因素的差異性分析，結(jié)果顯示TRIAP1、RPS27L和AEN均不受年齡因素（P分別為0.732、0.284、0.153）和性別因素（P分別為0.445、0.469、0.278）影響。
　　52Gy和8Gy照射小鼠并在照射后飼養(yǎng)不同時間，與對照組相比，TRIAP1基因在照射后0-48h隨時間的延長表達水平不斷上升，在24h、48h和72h表達水平具有顯著性差異（P＜0.05），在48h達到峰值15.18，72h略有下降；

13、RPS27L基因在4h和8h表達變化水平較高僅在8Gy劑量下4h與對照比無顯著性差異，12h迅速下降，24-72h逐漸恢復(fù)至接近本底水平；AEN基因在4h開始逐漸升高，24h達到峰值4.10，隨后逐漸下降，在8-72h表現(xiàn)出一定的差異性（P＜0.05）。TRIAP1、RPS27L和AEN基因在0Gy、2Gy和8Gy照射下無顯著劑量依賴關(guān)系。
　　結(jié)論:
　　1建立了TaqMan探針兩步法的實時熒光定量PCR的檢測方法。

14、>　　2γ射線不同劑量照射人外周血后培養(yǎng)不同時間，TRIAP1、RPS27L和 AEN在不同的時間點表達水平顯著升高并且具有較好的劑量依賴關(guān)系，提示這3個輻射敏感基因具有作為輻射損傷生物標(biāo)志物的潛力，適用于輻射損傷早期生物劑量的估算。TCL1A、SPIB基因時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)關(guān)系不顯著，C12orf5基因相對表達變化水平低，這3個基因不具有作為輻射敏感基因的潛力。
　　3通過本底水平的檢測，TRIAP1、RPS27L和 AEN基因