左歸丸對(duì)慶大霉素誘導(dǎo)耳腎損傷大鼠模型JNK-c-Jun通路的影響及機(jī)制.pdf

1、目的:探討左歸丸對(duì)慶大霉素誘導(dǎo)耳腎損傷大鼠模型JNK通路的影響及機(jī)制。
　　 方法:
　　 (1)將12只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、慶大霉素組。每組6只?？瞻讓?duì)照組腹腔注射生理鹽水2.5ml·kg-1·d-1，慶大霉素組腹腔注射硫酸慶大霉素100mg· kg-1· d-1。每日根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量。2組大鼠連續(xù)給藥10d。分別在給藥前和給藥后檢測大鼠聽力ABR閾值、尿NAG酶值，在

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)束取耳蝸和腎臟標(biāo)本進(jìn)行HE染色，在光鏡下觀察耳蝸和腎臟病理變化。
　　 (2)將18只SPF級(jí)Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組:空白對(duì)照組，模型組和左歸丸組。每組6只?？瞻讓?duì)照組腹腔注射生理鹽水2.5ml·kg-1·d-1，模型組腹腔注射硫酸慶大霉素100mg· kg-1· d-1，左歸丸組腹腔注射硫酸慶大霉素100mg· kg-1· d-1和灌胃左歸丸水溶液10g·kg-1·d-1。每日根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量。

3、3組大鼠連續(xù)給藥10d。分別在給藥前和給藥后檢測大鼠聽力ABR閾值、尿NAG酶值、大鼠體重變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測量大鼠腎臟指數(shù)，留取血液檢測Scr、BUN。留取耳蝸和腎臟標(biāo)本光鏡和電鏡下觀察病理變化。
　　 (3)將72只SPF級(jí)Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為4組:空白對(duì)照組，模型組、SP600125組和左歸丸組。每組18只?？瞻讓?duì)照組腹腔注射生理鹽水2.5ml·kg-1· d-1;模型組腹腔注射硫酸慶大霉素100mg·

4、kg-1·d-1; SP600125組左側(cè)腹腔注射硫酸慶大霉素100mg·kg-1·d-1，2h后右側(cè)腹腔注射SP60012515mg·kg-1·d-1;左歸丸組腹腔注射硫酸慶大霉素100mg· kg-1· d-1和灌胃左歸丸水溶液10g·kg-1·d-1。每日根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量。4組大鼠連續(xù)給藥10d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，留取耳蝸和腎臟標(biāo)本，以免疫組化方法、免疫印跡雜交方法、實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測JNK、p-JNK、c-Jun的表達(dá)和蛋白、

5、基因的含量。
　　 結(jié)果:
　　 (1)慶大霉素組大鼠腹腔注射100mg·kg-1·d-1×10d后，聽力ABR閾值和尿NAG酶值明顯升高，與空白對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。大鼠耳蝸、腎臟病理形態(tài)比較:空白對(duì)照組螺旋器毛細(xì)胞完整無缺失，排列整齊;腎臟小管、間質(zhì)無特殊改變。而慶大霉素組螺旋器毛細(xì)胞出現(xiàn)丟失、變性、排列不規(guī)則;腎小管出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，并出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、變性。
　　 (2)3組大鼠ABR閾

6、值、尿NAG酶、血Scr與BUN、腎臟指數(shù)結(jié)果:與空白對(duì)照組相比，模型組ABR閾值、尿NAG酶、血Scr與BUN、腎臟指數(shù)值明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）;與模型組相比，左歸丸組ABR閾值、尿NAG酶、血Scr與BUN、腎臟指數(shù)值明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或P＜0.01）。大鼠體重結(jié)果:與空白組相比，模型組大鼠體重?cái)?shù)值明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）;與模型組相比，左歸丸組大鼠體重?cái)?shù)值得到升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差

7、異（P＜0.05）。耳蝸、腎臟HE染色病理結(jié)果:空白對(duì)照組耳蝸螺旋器毛細(xì)胞無缺失，排列整齊;腎臟小管、間質(zhì)無特殊改變。而模型組耳蝸螺旋器毛細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、核破裂，毛細(xì)胞丟失嚴(yán)重;腎臟小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、變性和少量壞死。左歸丸組耳蝸毛細(xì)胞有少量丟失，排列尚可;腎臟小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)輕微腫脹、變性。透射電鏡超微病理結(jié)果:空白對(duì)照組耳蝸線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯改變;近曲腎小管上皮細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)正常，基底面有排列整齊的質(zhì)膜內(nèi)褶，胞漿及質(zhì)膜

8、內(nèi)褶間分布眾多線粒體。模型組耳蝸胞漿溶酶體增多，部分出現(xiàn)空泡化;近曲腎小管上皮細(xì)胞游離面局部微絨毛脫落，胞漿內(nèi)多處巨大囊泡擴(kuò)張。左歸丸組耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，部分胞漿空泡化;近曲腎小管微絨毛排列整齊，胞漿內(nèi)少量囊泡病變，管腔內(nèi)有少量絮狀物。
　　 (3) TUNEL細(xì)胞凋亡結(jié)果:空白對(duì)照組耳蝸和腎臟有少量凋亡細(xì)胞，模型組耳蝸和腎臟TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增多具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）;與模型組比較，左歸丸組和SP60

9、0125組耳蝸和腎臟TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。免疫組化結(jié)果:空白對(duì)照組耳蝸和腎臟JNK、p-JNK、c-Jun蛋白表達(dá)較少。與空白對(duì)照組相比，模型組JNK、p-JNK、c-Jun蛋白有大量表達(dá)，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。耳蝸主要集中在螺旋器、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)部位表達(dá);腎臟主要集中在腎小管部位。與模型組相比，左歸丸組和SP600125組表達(dá)減少，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。免疫

10、印跡雜交結(jié)果:與空白組相比，模型組耳蝸和腎臟JNK、p-JNK、c-Jun蛋白表達(dá)顯著升高，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）;與模型組相比，左歸丸組SP600125組耳蝸和腎臟JNK、p-JNK、c-Jun蛋白表達(dá)明顯下降，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果:與空白組相比，模型組內(nèi)耳和腎臟JNK mRNA和c-JunmRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.01);與模型組相比，SP600125組JNK mRNA和c-Jun

11、mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）。
　　 結(jié)論:
　　 (1)大鼠腹腔注射慶大霉素100mg·kg-1·d-1×10d可以成功建立耳腎損傷模型。
　　 (2)左歸丸能夠保護(hù)耳腎損傷大鼠的聽力和腎功能，能夠改善耳腎損傷大鼠耳蝸和腎臟病理狀況，能夠減輕病理性細(xì)胞凋亡狀態(tài)。
　　 (3) JNK/c-Jun通路對(duì)慶大霉素誘導(dǎo)的耳腎損傷模型中細(xì)胞凋亡起重要調(diào)控作用，激活的JNK/c-Jun通路促使病理性細(xì)胞凋