苜蓿根瘤菌內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶EndS-1在Escherichia coli和Pichia pastoris中表達(dá)及定位點(diǎn)突變的研究.pdf

1、纖維素是植物纖維的主要成分，約占其干重的30-50％，是目前分布最廣的天然碳水化合物，也是地球上最豐富、最廉價(jià)的可再生資源。隨著世界人口的激增、糧食和能源的短缺將日趨嚴(yán)重，可再生纖維素資源的開(kāi)發(fā)利用已引起全世界的普遍關(guān)注。纖維素酶是能降解纖維素為葡萄糖等簡(jiǎn)單糖類的一類酶系?，F(xiàn)在雖然已發(fā)現(xiàn)眾多生物可以產(chǎn)生纖維素酶，包括低等動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌和放線菌，有的纖維素酶，特別是來(lái)源于絲狀真菌(如木霉、黑曲霉)纖維素酶已被廣泛地應(yīng)用在食品、釀酒

2、、飼料加工、紡織、洗衣、農(nóng)業(yè)等眾多領(lǐng)域，但是發(fā)現(xiàn)新的纖維素酶，研究它們能否在工業(yè)化表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，能否進(jìn)行改造，研究是否具有應(yīng)用價(jià)值仍然是十分必要的。 幾年前，來(lái)源于苜蓿根瘤菌(SinorhizobiummelilotiM5NICS)的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶EndS基因被克隆鑒定出來(lái)，并成功地在大腸桿菌中表達(dá)，但表達(dá)量不高。為了研究EndS基因能否在大腸桿菌或高等真菌表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，我們首先采用了大腸桿菌組成型表達(dá)系統(tǒng)

3、來(lái)表達(dá)EndS基因，并進(jìn)行了培養(yǎng)條件優(yōu)化，結(jié)果表達(dá)量也不高。我們表達(dá)的是一個(gè)有3個(gè)氨基酸殘基不同于EndS酶的突變體EndS-1。通過(guò)對(duì)EndS-1性質(zhì)研究表明，突變體EndS-1在60℃、pH6.4-7.0活力最高，比活力達(dá)23.44IU/mg；在60℃、pH7.0，酶的半衰期為6.28小時(shí)。為了進(jìn)一步探討EndS-1基因能否在真核細(xì)胞中高分泌表達(dá)，我們選擇了甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)來(lái)探討EndS-1在此系統(tǒng)中的表達(dá)情況。通過(guò)基因克隆，表達(dá)載

4、體的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化，成功地在Pichiapastoris表達(dá)了EndS-1基因。EndS-1基因在甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)中基本表達(dá)30毫克/L以上，表達(dá)產(chǎn)物為分子量相差1K左右的兩種修飾糖蛋白(EndS-1a和EndS-1b)。通過(guò)對(duì)純化的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，同大腸桿菌表達(dá)的產(chǎn)物酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了比較表明糖基化對(duì)EndS-1的性質(zhì)有所影響：EndS-1b的比活力、穩(wěn)定性與大腸桿菌表達(dá)的EndS-1相比略有降低，而EndS-1a卻降低很多.

5、 通過(guò)分子模建分析表明，EndS-1被修飾的糖基化位點(diǎn)不在催化活性中心區(qū)域。為解決糖基化對(duì)EndS-1的性質(zhì)有所影響，本文通過(guò)N-糖基化位點(diǎn)突變，我們得到電泳鑒定條帶呈均一性的突變體EndS-2和EndS-4。突變結(jié)果表明EndS-1a為N-型糖基化修飾，其修飾位點(diǎn)在殘基222處。對(duì)突變體的性質(zhì)研究我們還發(fā)現(xiàn)EndS-2的比活力為20.39IU/mg，和EndS-1與EndS-1b相當(dāng);EndS-4的比活力為106.67IU/mg，但