PKC-NF-κB在大鼠晶狀體損傷后促進(jìn)視神經(jīng)再生的研究.pdf

1、視神經(jīng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，隨著哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成熟，視神經(jīng)損傷后的再生修復(fù)將變得極其困難。臨床上大多數(shù)創(chuàng)傷性視神經(jīng)疾病、退行性視覺通路疾病或缺血性視神經(jīng)損傷的患者將承受不可逆的視力損害，更嚴(yán)重的會導(dǎo)致視力完全喪失，因此關(guān)于視神經(jīng)損傷后再生修復(fù)的研究對于患者視力的提高及生活自信心的增強(qiáng)有重要的實(shí)踐意義。視神經(jīng)的起始部是視網(wǎng)膜處的視盤，而視網(wǎng)膜的視盤處匯集了大量視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglioncells，R

2、GCs)的軸突。在高等動物中，視網(wǎng)膜視覺輸出的相關(guān)細(xì)胞只有RGCs，所以關(guān)于視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的探討對視網(wǎng)膜的再生修復(fù)來說是很有必要的。目前，關(guān)于視神經(jīng)損傷后修復(fù)再生的方向主要關(guān)注于如何在視神經(jīng)損傷后保留更多的RGCs、如何使保留的RGCs軸突延長、如何恢復(fù)視覺靶點(diǎn)之間的聯(lián)系和功能三個(gè)方面。
　　晶狀體損傷如何促進(jìn)受損視神經(jīng)的再生是當(dāng)今科研范疇的一大熱點(diǎn)和難點(diǎn)。國內(nèi)外學(xué)者從調(diào)節(jié)各個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號通路、清除再生抑制因子、激活神

3、經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用神經(jīng)營養(yǎng)因子等方面進(jìn)行了一系列深入的探討，從不同方面都證明了大鼠視神經(jīng)損傷伴晶狀體損傷可以在一定水平上促進(jìn)視神經(jīng)的再生。本課題組對神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜中Müller細(xì)胞、Nogo-AmRNA及Nogo-A的表達(dá),巨噬細(xì)胞、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)、鋅指蛋白核轉(zhuǎn)錄因子4（Kruppel-like transcription factor4，KLF4）、白血病

4、抑制因子(1eukemia inhibitory factor,LIF)的實(shí)驗(yàn)研究中，一方面從不同的角度運(yùn)用了不同的方式探索了視神經(jīng)晶狀體聯(lián)合損傷促進(jìn)受損視神經(jīng)的再生修復(fù)的機(jī)制，另一方面也為視神經(jīng)損傷后的治療策略的制定、治療藥物的選用、治療效果的評估提供了新的思路。本次通過對視神經(jīng)損傷伴晶狀體損傷PKC活性與NF-κBp65蛋白表達(dá)量的研究，對晶狀體損傷后促進(jìn)視神經(jīng)再生的機(jī)制進(jìn)行更深一步的探索。
　　目的：
　　通過對單純視

5、神經(jīng)鉗夾損傷及視神經(jīng)鉗夾損傷聯(lián)合晶狀體損傷大鼠視網(wǎng)膜中PKC活性與NF-κBp65蛋白表達(dá)量的研究，初步探討視神經(jīng)損傷伴晶狀體損傷促進(jìn)視神經(jīng)再生修復(fù)的作用機(jī)制，證實(shí)晶狀體損傷可通過對PKC與NF-κBp65表達(dá)的調(diào)節(jié)來發(fā)揮保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的作用，為臨床治療視神經(jīng)損傷提供新的靶點(diǎn)和思路。
　　方法：
　　清潔健康Wistar成年大鼠60只,雌雄不分，按隨機(jī)數(shù)字表法分成四組：正常對照組6只(即A組)，假手術(shù)組18只（僅暴露而

6、不損傷視神經(jīng)組，即B組），視神經(jīng)鉗夾損傷組18只（即C組），視神經(jīng)鉗夾損傷聯(lián)合晶狀體損傷組18只(即D組)。A組于正常飼養(yǎng)7d后麻醉過量處死大鼠6只，B組、C組、D組于術(shù)后7d、14d、21d分別麻醉處死大鼠各6只。各組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取2只大鼠行熒光金逆行標(biāo)記后RGCs進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)，2只應(yīng)用氚標(biāo)記的二丁酸佛波醇脂（([3H]PDBu)）檢測各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜PKC的活性變化，2只行Western blot檢測視網(wǎng)膜NF-κBp65蛋

7、白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.熒光金標(biāo)記的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞
　　在熒光顯微鏡下觀察A組及B組大鼠視網(wǎng)膜鋪片中熒光金標(biāo)記的RGCs，可見被熒光金標(biāo)記的RGCs的形態(tài)學(xué)特征具有特異性，呈金黃色，形狀大多數(shù)為圓形或橢圓形，邊界較清晰，大小不一，部分細(xì)胞突起清晰可見,A組及B組RGCs分布在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較穩(wěn)定。而C、D組視網(wǎng)膜鋪片，隨著鉗夾損傷時(shí)間的增加，RGCs的分布逐漸稀疏，RGCs的形狀縮小變圓，熒光著色增強(qiáng)，

8、突起腫脹或消失。損傷后7d、14d、21d同一時(shí)間點(diǎn)C、D組與B組RGCs計(jì)數(shù)及標(biāo)識率相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P<0.05）；同一時(shí)間點(diǎn)，D組RGCs計(jì)數(shù)高于C組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）；而A、B兩組RGCs計(jì)數(shù)相互比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。
　　2.各組PKC活化水平之間相互比較
　　A組及B組PKC活化水平基本穩(wěn)定，C組及D組視網(wǎng)膜在傷后7d、14d、及21d均可見PKC的活性增加，

9、PKC的活性在視神經(jīng)鉗夾傷后7d后顯著增加，并在視神經(jīng)鉗夾傷后14d達(dá)到高點(diǎn)，在21d在仍維持較高水平。B組暴露視神經(jīng)后7d、14d、及21d的PKC活性與A組PKC的活性相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；C組及D組視神經(jīng)鉗夾傷后7d、14d、21d與B組同一時(shí)間點(diǎn)PKC的活性相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；同一時(shí)間點(diǎn)，D組神經(jīng)鉗夾傷后PKC的活性高于C組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3.各組NF-κBp65

10、蛋白表達(dá)量之間相互比較
　　A組、B組NF-κBp65蛋白表達(dá)量相互比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），C組及D組視網(wǎng)膜視神經(jīng)鉗夾傷后可見NF-κB p65蛋白表達(dá)量增加，在視神經(jīng)鉗夾傷后14d后達(dá)到高點(diǎn)后開始下降。在相同時(shí)間點(diǎn)C、D兩組相互比較，C組神經(jīng)鉗夾傷后的NF-κB p65蛋白表達(dá)量高于D組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.隨著視神經(jīng)鉗夾損傷后時(shí)間的延長，RGCs計(jì)數(shù)不斷下降，