NGF緩釋系統(tǒng)促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)電損傷后再生的研究.pdf

1、研究背景與總體思路 現(xiàn)已證實(shí)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)具有明確的促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后再生的作用，但在實(shí)際應(yīng)用中，由于NGF活性半衰期較短，在水溶液中易失活，且易受濕度、酸堿度等多種因素的影響，因而限制了其臨床應(yīng)用。為此，尋找合理有效的給藥途徑及制劑已成為當(dāng)務(wù)之急。 為此，我們?cè)O(shè)想：制備一種NGF緩釋系統(tǒng)，這種系統(tǒng)能延緩釋放NGF，且釋放的NGF具有生物活性，將其應(yīng)用于周圍神經(jīng)電損傷段

2、局部，使其在局部緩慢釋放活性NGF，可能在神經(jīng)再生過(guò)程中維持較長(zhǎng)時(shí)間的作用，促進(jìn)周圍神經(jīng)再生。 第一部分：NGF緩釋系統(tǒng)的制備及釋放性能測(cè)定 目的：制備β-NGF緩釋系統(tǒng)，通過(guò)Sandwich ELISA法建立β-NGF標(biāo)準(zhǔn)釋放曲線及體外釋放曲線，并通過(guò)DRG組織培養(yǎng)法評(píng)價(jià)β-NGF緩釋系統(tǒng)中釋放的β-NGF是否具有生物活性及該系統(tǒng)中各組成成分的作用和必要性。 1、NGF緩釋系統(tǒng)的制備及體外釋放曲線的建立

3、 方法：利用纖維蛋白作為釋放系統(tǒng)基質(zhì)，加入肝素、肝素結(jié)合肽、β-NGF及含Ca<'2+>的凝血酶制成β-NGF緩釋系統(tǒng)，加入24孔組織培養(yǎng)板內(nèi)，37℃，95％相對(duì)濕度，5％CO<,2>培養(yǎng)箱中培育5-10min，聚集成膠狀物，然后每天加500μl／孔TBS液輕輕沖洗，小心吸取沖洗液收集于EP管內(nèi)，共6天，最后加100μl／孔含纖溶酶的TBS液將基質(zhì)完全溶解，收集基質(zhì)溶解液于EP管中，用Sandwich ELISA法測(cè)定每天沖洗液含有的β

4、-NGF的量和最后基質(zhì)溶解液中剩余β-NGF的量，建立β-NGF濃度-時(shí)間釋放曲線。實(shí)驗(yàn)分組如下： 實(shí)驗(yàn)組：fibrin+heparin+peptide+100ng／ml β-NGF 對(duì)照組：fibrin+100nq／mlβ-NGF 結(jié)果：制備的β-NGF緩釋系統(tǒng)為一層白色透明膠狀物。第一天，不含肝素及肝素結(jié)合肽組有98.23％的NGF釋放出來(lái)，而NGF緩釋系統(tǒng)組只釋放21.37％，明顯少于對(duì)照組(P<0.01)

5、；對(duì)照組最后的基質(zhì)溶解液中無(wú)NGF剩余，而實(shí)驗(yàn)組仍有48.92％的NGF剩余(p<0.01)。上述結(jié)果表明：在體外無(wú)細(xì)胞存在情況下，實(shí)驗(yàn)組能明顯延緩NGF的釋放。 2、NGF緩釋系統(tǒng)中釋放NGF的活性測(cè)定 方法：用含不同濃度β-NGF的緩釋系統(tǒng)進(jìn)行DRG培養(yǎng)，確定其能否促進(jìn)DRG軸突生長(zhǎng)及β-NGF的最佳濃度；然后分成以下不同組別進(jìn)行DRG培養(yǎng)，以評(píng)價(jià)β-NGF緩釋系統(tǒng)中各組成成分的作用及必要性。分組如下：

6、 Control Group：DRG+fibrin GrOuD a：DRG+fibrIn+peptide+heparin+100ng／ml β-NGF Group b：DRG+fibrin+heparin+100ng／mlβ-NGF Group c：DRG+fibrin+peptide+100ng／mlβ-NGF Group d：DRG+fibrin+100ng／ml β-NGF

7、 Group e：DRG+fibrin+peptide+heparin 結(jié)果：β-NGF緩釋系統(tǒng)可明顯促進(jìn)DRG軸突生長(zhǎng)。β-NGF濃度在100ng／ml時(shí)緩釋系統(tǒng)促進(jìn)DRG軸突生長(zhǎng)最明顯，因而選擇此濃度為實(shí)驗(yàn)的初始濃度。當(dāng)β-NGF緩釋系統(tǒng)中所有成分均存在時(shí)(Group a)，促進(jìn)DRG軸突生長(zhǎng)能力最強(qiáng)，為對(duì)照組的3.75倍(P<0.01)，b、c、d組只有少量細(xì)短的神經(jīng)纖維從神經(jīng)節(jié)長(zhǎng)出，分別為對(duì)照組的1.15

8、、1.12、1.10倍，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，組間對(duì)照差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，e組促進(jìn)軸突生長(zhǎng)能力與對(duì)照組比較也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。上述結(jié)果表明：β-NGF緩釋系統(tǒng)中各組成成分(肝素結(jié)合肽、肝素、β-NGF)缺一不可，對(duì)于β-NGF的緩釋作用是必不可少的。 結(jié)論： ①本實(shí)驗(yàn)配制的β-NGF緩釋系統(tǒng)在體外無(wú)細(xì)胞存在情況下可以明顯延緩β-NGF的釋放，培育6天后，在最后的基質(zhì)中仍有近50％的β

9、-NGF剩余。 ②β-NCF緩釋系統(tǒng)中釋放的β-NGF具有生物活性，可明顯促進(jìn)DRG軸突生長(zhǎng)。③β-NGF緩釋系統(tǒng)促進(jìn)DRG軸突生長(zhǎng)具有濃度依賴性，在100ng／ml時(shí)效果 最好。 ④β-NCF緩釋系統(tǒng)中各組成成分(肝素、肝素結(jié)合肽、β-NGF)缺一不可，對(duì)于延緩β-NCF的釋放是必不可少的。 第二部分：大鼠坐骨神經(jīng)電損傷模型的制備 目的：采用電升壓裝置和相關(guān)設(shè)備，預(yù)設(shè)置一個(gè)放電裝置，電擊SD大鼠右側(cè)坐

10、骨神經(jīng)，模擬臨床電擊傷中神經(jīng)損傷過(guò)程，建立穩(wěn)定的盡量模擬臨床以“真性電損傷”為主的坐骨神經(jīng)電損傷動(dòng)物模型，觀察其形態(tài)學(xué)變化并進(jìn)行功能評(píng)價(jià)，探討其可能的損傷機(jī)制，客觀評(píng)價(jià)神經(jīng)電損傷后的再生能力，為下一步的實(shí)驗(yàn)研究提供參考。 方法：SD大鼠54只，隨機(jī)分為三組，GroupⅠ(250V組)、GroupⅡ(500V組)、GroupⅢ(1000V組)，顯露大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)并用絕緣材料將其與周圍組織隔離，分別用實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的電壓(250V、5

11、00V、1000V)實(shí)施電擊。電擊時(shí)間設(shè)置為10ms，電擊后迅即解除電極，分層縫合切口。分別于傷后1w、4w、12w時(shí)相點(diǎn)隨機(jī)抽取每組實(shí)驗(yàn)大鼠六只進(jìn)行大體形態(tài)學(xué)觀察、坐骨神經(jīng)功能指數(shù)和神經(jīng)傳導(dǎo)速度測(cè)定，并對(duì)損傷神經(jīng)進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)。 結(jié)論： 在相同的致傷條件下，電壓越高造成的神經(jīng)損傷范圍越廣泛，程度越嚴(yán)重；不同的電擊電壓能不同程度地?fù)p傷神經(jīng)并出現(xiàn)不同的預(yù)后，250V損傷組大都能通過(guò)自我修復(fù)恢復(fù)功能，1000V損傷組基本上不

12、能完全自我修復(fù)，而500V損傷組有部分自我修復(fù)能力但不完全，12w后功能仍受限。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該模型能較好地模擬臨床以“真性電損傷”為主的電擊傷過(guò)程。 第三部分：NGF緩釋系統(tǒng)促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)電損傷后再生的研究目的：造成大鼠坐骨神經(jīng)電損傷后，將含有β－N6F的纖維蛋白緩釋系統(tǒng)應(yīng)用于受損神經(jīng)段局部，研究β-NGF緩釋系統(tǒng)對(duì)周圍神經(jīng)電損傷后再生的影響，為進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供參考。l、N6F緩釋系統(tǒng)對(duì)電損傷神經(jīng)GAP-43蛋白

13、及其mRNA表達(dá)的影響方法：模型完成后動(dòng)物按隨機(jī)表分為三組，每組24只動(dòng)物。 A組：只造成坐骨神經(jīng)電損傷模型，直接縫合切口。 B組：神經(jīng)外用β-NGF緩釋系統(tǒng)，縫合切口。 C組：神經(jīng)外直接用纖維蛋白基質(zhì)+β-NGF，縫合切口。 結(jié)果：術(shù)后1w時(shí)，三組大鼠脊髓組織GAP-43mRNA均有少量表達(dá)，組間比較差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)；術(shù)后2w時(shí)，B組GAP-43mRNA表達(dá)量明顯升高，高于C、A

14、兩組，與C、A組比較差異有極為顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，C、A組表達(dá)量略有升高，但兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)；術(shù)后4w時(shí)，B組GAP-43mRNA仍有持續(xù)高表達(dá)，明顯高于C、A組(p＜0.01)，而C、A組表達(dá)量較2w周時(shí)下降，但兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)；術(shù)后8w時(shí)，C、A組GAP-43mRNA不表達(dá)，B組表達(dá)量較4w時(shí)明顯下降，但仍有少量表達(dá)，與C、A組比較有極為顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01

15、)。坐骨神經(jīng)電損傷段近端GAP-43蛋白染色強(qiáng)度呈現(xiàn)出類似變化規(guī)律。 2、NGF緩釋系統(tǒng)應(yīng)用于大鼠坐骨神經(jīng)電損傷段后形態(tài)和功能學(xué)觀察 方法：動(dòng)物隨機(jī)分為三組，每組12只動(dòng)物。 A組：只造成坐骨神經(jīng)電損傷模型，直接縫合切口。 B組：神經(jīng)外用β-NGF緩釋系統(tǒng)，縫合切口。 C組：神經(jīng)外直接用纖維蛋白基質(zhì)+β-NGF，縫合切口。 分別于術(shù)后8w、12w時(shí)相點(diǎn)，通過(guò)顯微結(jié)構(gòu)觀察、坐骨神經(jīng)功能指數(shù)

16、、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度等指標(biāo)測(cè)定大鼠坐骨神經(jīng)電損傷后不同處理組的形態(tài)改變及功能評(píng)定，評(píng)價(jià)其對(duì)電損傷后神經(jīng)再生的影響。 結(jié)果：術(shù)后即刻三組大鼠右后肢均出現(xiàn)失神經(jīng)支配現(xiàn)象，至12w時(shí)B組足底潰瘍基本愈合，C、A組未完全愈合。通過(guò)術(shù)后連續(xù)觀察SFI恢復(fù)情況，結(jié)果顯示，B組SFI恢復(fù)率明顯優(yōu)于C組和A組(p＜0.01)，C組略優(yōu)于A組(p＜0.05)；B組神經(jīng)傳導(dǎo)速度的恢復(fù)率明顯優(yōu)于C組和A組(p＜0.01)，C組神經(jīng)傳導(dǎo)速度的恢復(fù)率也略優(yōu)

17、于A組(p＜0.05)。術(shù)后8w、12w，B組坐骨神經(jīng)損傷段近端再生神經(jīng)纖維直徑、密度、髓鞘厚度明顯優(yōu)于C組與A組(p＜0.01)，C組與A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。 結(jié)論： ①β-NGF緩釋系統(tǒng)應(yīng)用于大鼠坐骨神經(jīng)電損傷段局部后，相對(duì)應(yīng)的脊髓神經(jīng)元GAP-43mRNA及坐骨神經(jīng)損傷段GAP-43蛋白的表達(dá)在2w-4w時(shí)持續(xù)升高，明顯高于對(duì)照組，8w時(shí)仍有較弱表達(dá)，而對(duì)照組不表達(dá)。表明β-NGF緩釋系