龍須藤多糖提取純化及其對軟骨細(xì)胞活性的影響.pdf

1、目的:
　　 本課題旨在優(yōu)選龍須藤多糖提取純化的工藝條件，并且分析了龍須藤多糖中的單糖組成，在此基礎(chǔ)上研究了龍須藤多糖對軟骨細(xì)胞活性的影響，為龍須藤多糖的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.水提醇沉法提取龍須藤多糖，苯酚硫酸法測定多糖含量，通過單因素實(shí)驗(yàn)確定影響龍須藤多糖提取的主要影響因素，然后在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法分析提取因素對龍須藤多糖含量的影響;考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量，以多

2、糖損失率和蛋白去除率為考察指標(biāo)比較了除蛋白的方法;三氟乙酸水解多糖成單糖，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生水解后的單糖，衍生物采用高效液相色譜法測定多糖中單糖的組成。
　　 2.Ⅱ型膠原酶消化法分離4周齡SD大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的軟骨細(xì)胞，體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞;免疫組化染色法鑒定軟骨細(xì)胞;MTT法檢測龍須藤多糖對軟骨細(xì)胞活性的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測龍須藤多糖對軟骨細(xì)胞周期分布的影響;RT-PCR檢測CyclinD1、CDK4、CDK6基

3、因的表達(dá);Western-blot檢測CyclinD1、CDK4、CDK6蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.龍須藤多糖提取的最優(yōu)條件為:提取溫度100℃、提取時(shí)間4h、料液比為1∶23、提取次數(shù)為2次，在此條件下龍須藤多糖提取率的理論值為3.12％，實(shí)測值為2.98％;Sevage法、木瓜蛋白酶-Sevage法、三氯乙酸-Sevage法、三氯乙酸-正丁醇法蛋白去除率分別為46.21％、71.43％、81.12％、88

4、.11，多糖損失率分別為33.73％、18.51％、43.40％、28.15％;龍須藤多糖由葡萄糖、鼠李糖、半乳糖組成。
　　 2.軟骨細(xì)胞經(jīng)Ⅱ型膠原染色，胞漿呈棕黃色;MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明龍須藤多糖作用軟骨細(xì)胞24 h、48 h，軟骨細(xì)胞增殖效果明顯(P＜0.05)，作用72 h，增殖效果不明顯(P＞0.05);不同濃度的龍須藤多糖(50、100、200、400μg/ml)干預(yù)軟骨細(xì)胞48 h，結(jié)果表明多糖濃度100μg/ml，

5、增殖作用較好。
　　 3.流式細(xì)胞儀測出的結(jié)果表明，不同濃度的龍須藤多糖干預(yù)軟骨細(xì)胞，與空白組相比，G1期的細(xì)胞數(shù)減少，S期的細(xì)胞數(shù)增多(P＜0.05); RT-PCR與Western-blot的結(jié)果表明:軟骨細(xì)胞CyclinD1、CDK4、CDK6的表達(dá)高于空白組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.響應(yīng)曲面法優(yōu)化龍須藤多糖的提取條件簡單，準(zhǔn)確;木瓜蛋白酶-Sevage法脫蛋白較好;龍須藤多糖的水解產(chǎn)物有