納米微粒固載抗體蛋白構(gòu)建高靈敏電流型免疫傳感器的研究.pdf

1、發(fā)展高靈敏的免疫分析技術(shù)一直是免疫分析領(lǐng)域研究的一個(gè)重要方面，它對(duì)于實(shí)現(xiàn)一些重要疾病標(biāo)志物的檢測(cè)有著至關(guān)重要的意義。電化學(xué)儀器具有簡(jiǎn)便、靈敏、易于微型化和集成化等優(yōu)點(diǎn)，電化學(xué)儀器被廣泛研究并已在生物檢測(cè)中逐步得到應(yīng)用。電化學(xué)免疫傳感器利用抗原和抗體間的高度特異性結(jié)合，將傳統(tǒng)的免疫測(cè)試方法與近代生物傳感技術(shù)融為一體，該技術(shù)既具有免疫反應(yīng)的高選擇性又兼有電化學(xué)分析的高靈敏性，被廣泛應(yīng)用于臨床診斷領(lǐng)域。納米生物技術(shù)是納米技術(shù)與生物技術(shù)交叉滲透

2、形成的新技術(shù)，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要發(fā)展方向。納米粒子特別是殼/核型納米粒子具有優(yōu)良的電學(xué)、磁學(xué)、光學(xué)性質(zhì)以及優(yōu)越的生物相容性，可用于固定抗體，在免疫分析中已得到廣泛的應(yīng)用。 本論文將納米技術(shù)、生物傳感技術(shù)和電化學(xué)分析技術(shù)結(jié)合用于免疫分析。應(yīng)用碳納米管、納米金、納米二氧化鈦、摻雜納米二氧化硅以及殼/核型普魯士藍(lán)等納米材料，采用不同方法在金電極表面構(gòu)建功能化生物分子固定界面，制備了一系列高靈敏的電化學(xué)免疫傳感器；用掃描電鏡（S

3、EM）、透射電鏡（TEM）、光譜技術(shù)、電化學(xué)分析技術(shù)對(duì)電極的組裝過程、功能界面進(jìn)行了表征；探討了其在生物分析方面的應(yīng)用。本文開展了如下工作： 1.采用反向微乳液法，合成出羧酸二茂鐵摻雜的SiO2新型納米粒子，將制得的納米粒子表面氨基化后，通過簡(jiǎn)單的戊二醛連接反應(yīng)固定癌抗體15-3（anti-CA15-3）的方法來構(gòu)建免疫傳感器。該電流型免疫傳感器不僅生物相容性好，固定抗體也簡(jiǎn)單方便。制備的傳感器中，羧酸二茂鐵摻雜SiO2納米粒

4、子可以直接給出電信號(hào)，經(jīng)透射電鏡（TEM）和X射線電子能譜（XPS）表征，羧酸二茂鐵摻雜在SiO2的Si-O-Si組成的籠中，不易泄漏。該傳感器在壽命和靈敏度方面顯示出優(yōu)勢(shì)。線性范圍2.0～240 U/mL，檢出限0.64 U/mL（S/N=3）。 2.制備出牛血清白蛋白（BSA）包覆的普魯士藍(lán)（PB）納米粒子，再修飾一層金納米粒子。該殼/核型納米粒子有三層結(jié)構(gòu)。BSA包覆PB納米粒子有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）BSA可以保護(hù)PB納米粒

5、子，防止其聚集；（2）BSA不僅生物相容性優(yōu)于其它材料，而且由于BSA具有多個(gè)氨基和巰基，可以更加方便的在其外部修飾另一層金納米粒子；（3）內(nèi)部的PB具有電化學(xué)活性，而經(jīng)BSA包覆后不易流失。分布在外表面大量的金納米粒子不僅具有較大的比表面積，可以吸附更多抗體，而且使電子傳輸效率增強(qiáng)，同時(shí)納米金還容易牢固的吸附生物分子。以此納米粒子固定AFP抗體，成功構(gòu)建了高靈敏的電流型AFP免疫傳感器。該免疫傳感器線性范圍為0.02～200.0 ng

6、/mL，檢出限0.006 ng/mL（S/N=3）。 3.首次提出硫堇共價(jià)鍵合苝四甲酸，鍵合產(chǎn)物再與納米TiO2形成有機(jī)/無機(jī)納米復(fù)合膜。TiO2成膜能力好，在金電極表面形成大的比表面，有利于增加甲胎蛋白（AFP）抗體在電極表面的固載量。同時(shí)，硫堇共價(jià)鍵合苝四甲酸的產(chǎn)物具有電活性，電子傳輸能力強(qiáng)，其氨基利于結(jié)合納米金，從而構(gòu)建出生物相容性好的AFP抗體固載界面。用該方法制得的免疫傳感器線性范圍為2.5-200.0ng/mL，檢

7、出限0.5 ng/mL（S/N=3）。 4.利用苝四甲酸酐與1，3－丙二胺的胺解產(chǎn)物、鄰苯二胺、變價(jià)過渡金屬離子CO2+制備了新型具有電化學(xué)活性的物質(zhì)，該物質(zhì)電子傳輸性能好，電極反應(yīng)可逆，可以作為電化學(xué)活性探針使用，而且因其含有很多氨基，便于進(jìn)一步結(jié)合納米金。本研究使用碳納米管與制備的電化學(xué)活性物質(zhì)共同修飾金電極，形成比表面積大、吸附性能強(qiáng)且具有高導(dǎo)電能力的納米粒子層，利用納米金能與氨基（-NH2）共價(jià)鍵合的特點(diǎn)在電活性物質(zhì)上

8、固定納米金，又以納米金固定AFP抗體制備出AFP免疫傳感器，該傳感器穩(wěn)定性好，線性范圍0.20～120 ng/mL，檢測(cè)限為0.12 ng/mL（S/N=3）。 5.采用酶標(biāo)記的生物素-親和素生物反應(yīng)放大系統(tǒng)，并結(jié)合納米鉑對(duì)H2O2的催化作用構(gòu)建了信號(hào)放大的新型電化學(xué)免疫傳感器。首先在電極上修飾一層納米金摻雜的碳納米管后，固定親和素，然后利用生物素一親和素反應(yīng)固定生物素標(biāo)記的AFP抗體，從而制得AFP免疫傳感器。采用雙抗體夾心

9、分析模式測(cè)定，將生物素標(biāo)記的二抗蛋白結(jié)合到免疫復(fù)合物上，再通過親和素-生物素的高特異和高親合力作用，夾心免疫反應(yīng)后的電極表面將捕獲標(biāo)記有辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的親和素與鉑納米顆粒的復(fù)合物。為了最大程度獲得電化學(xué)信號(hào)，再次利用具有多結(jié)合位點(diǎn)的親和素與標(biāo)記HRP的生物素結(jié)合，以進(jìn)一步增加HRP的固載量。在HRP底物H2O2的存在下可以得到鉑納米顆粒-HRP復(fù)合物共同作用底物產(chǎn)生的催化放大電流信號(hào)；并且由于電極界面納米金摻雜的碳納米管的

10、修飾，在增加電極比表面積，改善電極表面與生物分子之間的電子傳輸能力的同時(shí)還能有效降低HRP的氧化還原過電位，而且使免疫電極表面生物相容性更加優(yōu)異；生物素與親和素之間具有高度親和力，抗體分子經(jīng)生物素化后，其結(jié)合抗原的活性不受影響，酶生物素化后，其催化活性基本保持不變。該免疫傳感器將鉑納米粒子和HRP的催化放大作用有機(jī)結(jié)合，能有效放大響應(yīng)電流信號(hào)，顯著提高靈敏度。用該方法制得的AFP免疫傳感器線性范圍為0.25～100.0 ng/mL，檢出