瑪咖中特征活性成分制備與抗疲勞作用研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏和壓力不斷變大，人們可能伴隨著不同程度的疲勞癥狀，長(zhǎng)期處于精神和體力疲勞狀態(tài)，危害人體免疫功能等，進(jìn)而導(dǎo)致各類疾病的發(fā)生發(fā)展。隨著人們對(duì)以疲勞為代表的亞健康狀態(tài)關(guān)注度不斷提升，從天然來(lái)源動(dòng)植物和微生物中探索安全有效的抗疲勞活性成分和產(chǎn)品，已成為目前科學(xué)研究和產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。
　　瑪咖屬于十字花科類草本植物（溫、甘、平，歸肺、腎經(jīng)），含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和次級(jí)代謝產(chǎn)物，已知的生物活性包括：提高性功能、緩解體力疲勞和作為

2、脂肪酸水解酶抑制劑等，然而很多生物功效的物質(zhì)基礎(chǔ)還不清楚?，斂０奉悊误w化合物作為瑪咖中特有的次級(jí)代謝產(chǎn)物，被廣泛認(rèn)為是瑪咖生物活性的功能成分之一，然而受限于瑪咖中酰胺類化合物含量低、種類多，且單體間結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似等因素，瑪咖酰胺單體獲取困難。因此，目前與瑪咖相關(guān)的研究集中于瑪咖酰胺單體化合物的發(fā)現(xiàn)和定性定量分析、瑪咖及其提取物的藥理藥效研究，產(chǎn)品開(kāi)發(fā)也大都集中于瑪咖粗加工和粗提物應(yīng)用領(lǐng)域。
　　為了更深入研究瑪咖的生物活性物質(zhì)基

3、礎(chǔ)和功效，我們認(rèn)為，瑪咖酰胺的更高效提取和規(guī)?；苽涫乾斂顚哟窝芯亢烷_(kāi)發(fā)的必經(jīng)之路。本課題擬從天然瑪咖酰胺提取和化學(xué)合成的角度分別出發(fā)，開(kāi)發(fā)瑪咖酰胺單體化合物的制備和合成工藝，為瑪咖中特征成分的藥理藥效評(píng)價(jià)提供物質(zhì)基礎(chǔ)；考察所制備瑪咖酰胺的抗疲勞作用，以期為瑪咖產(chǎn)品深層次開(kāi)發(fā)提供新思路和參考。
　　目的：設(shè)計(jì)從瑪咖中提取瑪咖酰胺類單體化合物最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)工藝，并探索富集瑪咖酰胺新方法；設(shè)計(jì)瑪咖中主要瑪咖酰胺類單體的合成和純化工藝，并

4、探索大量合成高純度瑪咖酰胺的新思路；體內(nèi)評(píng)價(jià)N-芐基十六碳酰胺對(duì)小鼠體力疲勞作用效果及其相關(guān)指標(biāo)變化。
　　方法：采用超聲提取瑪咖粉的方法富集瑪咖酰胺，首次提出了酸堿反應(yīng)減少主要雜質(zhì)（脂肪酸類），并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，在料液比、超聲時(shí)間、溶劑類型、氫氧化鈉添加量和反應(yīng)時(shí)間等方面，優(yōu)化提取工藝。進(jìn)一步探索瑪咖中主要瑪咖酰胺的合成工藝，結(jié)合前人酰胺鍵合成的經(jīng)驗(yàn)，采用最傳統(tǒng)酰胺鍵合成方法即碳二亞胺縮合法，利用不同的脂肪酸包括亞麻酸，亞油酸和硬

5、脂酸等，由碳二亞胺類縮合劑活化脂肪酸中的羧基，再和芐胺或間甲氧基芐胺結(jié)合，生成瑪咖酰胺類化合物。反應(yīng)過(guò)程中加入酰胺鍵的催化劑和縛酸劑，加快合成反應(yīng)的速率；對(duì)合成產(chǎn)物采用酸堿反應(yīng)、重結(jié)晶和硅膠柱等純化方法，得到大量高純度的瑪咖酰胺，通過(guò)一系列的檢測(cè)方法包括1H和13C NMR，MS-ESI，IR和HPLC-DAD，證明合成的單體就是瑪咖酰胺類化合物。為了進(jìn)一步確定瑪咖酰胺是瑪咖藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，選擇N-芐基十六碳酰胺單體屬于瑪咖酰胺類化合物

6、，評(píng)價(jià)其緩解小鼠體力疲勞效果，并在四個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)觀察小鼠體重和負(fù)重游泳時(shí)間的變化；體內(nèi)指標(biāo)采用試劑盒法檢測(cè)小鼠肝糖元、尿素氮、乳酸脫氫酶、血胺和血乳酸含量的變化，簡(jiǎn)單探討瑪咖酰胺緩解體力疲勞的功效。
　　結(jié)果：
　　1.瑪咖中主要酰胺類化合物的提取工藝優(yōu)化研究
　　通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)工藝，得出在最優(yōu)條件如下：以乙醚為提取溶劑，料液比1:30（g/mL），超聲時(shí)間30min；酸堿反應(yīng)的最佳條件為：氫氧化鈉添加量1:

7、5（g/mL），反應(yīng)溫度50℃和酸堿反應(yīng)時(shí)間50min。提取物UV色譜圖顯示，其中主要含有五種瑪咖酰胺單體化合物，這里將五種酰胺類單體總含量計(jì)算成瑪咖中瑪咖酰胺類化合物的總含量，在這樣的條件下，提取物中的瑪咖酰胺含量為20.79％，相對(duì)于DBS53/001—2015《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)瑪咖干制品》中的提取方法，它的相對(duì)含量上升了73.9%。
　　2.合成瑪咖中主要的五種瑪咖酰胺類單體化合物
　　利用1H和13C NMR，MS-

8、ESI，IR和HPLC-DAD等方法檢測(cè)最終產(chǎn)物，結(jié)果表明：合成的單體化合物就是瑪咖中五種主要的單體化合物即間甲氧基-芐基-亞麻酰胺，芐基-亞麻酰胺，間甲氧基-芐基-亞油酰胺，芐基-亞油酰胺和芐基-十六烷酰胺，且它們的大概純度分別為97.63%,95.71%,96.21%,95.13%和95.92%。
　　3.評(píng)價(jià)N-芐基十六碳酰胺緩解小鼠體力疲勞能力
　　C57小鼠每天被灌胃N-芐基十六碳酰胺單體，持續(xù)30天，在不同的時(shí)間

9、點(diǎn)檢測(cè)小鼠的體重和負(fù)重游泳時(shí)間變化，最后嚴(yán)格按照不同試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)方法，檢測(cè)小鼠血清中指標(biāo)和肝臟中糖原含量，結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組小鼠（灌胃瑪咖酰胺類單體）與空白組相比，小鼠體重變化沒(méi)有顯著性差異，而實(shí)驗(yàn)組中小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間和肝糖原含量，都顯著高于空白組；空白組小鼠其他血清中的指標(biāo)如血乳酸、乳酸脫氫酶、血胺和尿素氮含量等，均顯著性高于實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果表明，N-芐基十六碳酰胺單體作為瑪咖中特有的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是緩解小鼠體力疲勞的功效成分之一。

10、>　　結(jié)論：瑪咖中酰胺類單體化合物是極性最弱的酰胺類生物堿之一，利用其特殊的理化性質(zhì)，采用乙醚作為瑪咖酰胺最佳的超聲提取溶劑，極大的富集瑪咖中五種主要的單體化合物，同時(shí)采用酸堿反應(yīng)方法，顯著的減少脂肪酸類等雜質(zhì)，純化瑪咖酰胺類單體；在探索提取工藝過(guò)程中，提出了碳二亞胺類縮合法，是瑪咖酰胺合成的有效途徑，既通過(guò)酸堿反應(yīng)和重結(jié)晶等方法純化瑪咖酰胺單體化合物，得到大量高純度的瑪咖酰胺類單體。藥理實(shí)驗(yàn)表明，其中 N-芐基-十六碳酰胺作為結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)