大豆異黃酮Genistein的腦缺血保護(hù)活性及以煙草作為生物反應(yīng)器產(chǎn)生Genistein的初步研究.pdf

1、異黃酮Genistein是大豆中的一種次生代謝物，它可通過對動物及人體細(xì)胞和分子水平的多種調(diào)控機(jī)制，預(yù)防疾病發(fā)生，發(fā)揮健康效應(yīng)。通過尋找植物異黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，采用遺傳轉(zhuǎn)化的手段，增加非豆科植物中Genistein含量，可提供更廣泛的異黃酮來源，促進(jìn)人體健康。本研究在整體動物和體外細(xì)胞模型中，較為系統(tǒng)地研究了Genistein腦缺血保護(hù)相關(guān)的藥理學(xué)活性，并闡明其保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)理;通過調(diào)控異黃酮代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因，以非豆科

2、植物煙草作為生物反應(yīng)器，在煙草中表達(dá)影響Genistein合成的基因并觀察其積累。主要研究結(jié)果有以下幾點(diǎn):
　　1.通過建立小鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)及再灌注模型，評價Genistein的抗腦缺血保護(hù)活性。Genistein（2.5，5，10 mg/kg）連續(xù)灌胃給予14 d可明顯降低腦缺血再灌注小鼠的腦梗塞率，提高神經(jīng)行為學(xué)評分，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡率。Genistein預(yù)處理可抑制缺血腦組織及線粒體中活性氧(ROS)的生成，增

3、加超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的活性，并降低丙二醛(MDA)含量，體現(xiàn)出良好的抗氧化作用。Genistein可改善缺血后的線粒體功能障礙，表現(xiàn)為阻止細(xì)胞色素C由線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，并抑制凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3的活化。此外，Genistein可有效阻斷在缺血條件下ROS誘導(dǎo)的核因子-κB(NF-κB)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活:通過下調(diào)NF-κB/p65的表達(dá)和磷酸化、阻止抑制蛋白κBa(IκBa)的降解及磷酸化，

4、對整個信號通路起抑制作用。以上結(jié)果表明，Genistein對于局灶性腦缺血小鼠的保護(hù)作用可能與直接和間接的抗細(xì)胞氧化、改善線粒體功能以及抑制NF-κB信號通路激活相關(guān)。
　　2.在外源性過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷模型中，通過形態(tài)學(xué)觀察、免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定和western blot檢測，我們發(fā)現(xiàn)Genistein（0.01-1μM）預(yù)處理24 h可有效抵抗500μM H2O2介導(dǎo)的細(xì)胞存活率下降和ROS的過量積累。Genis

5、tein可顯著抑制神經(jīng)元凋亡，逆轉(zhuǎn)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的比值，抑制caspase-9和caspase-3的活性。在體外實(shí)驗(yàn)中，我們同樣觀察到Genistein可下調(diào)NF-κB/p65的表達(dá)，并抑制p65和IκBa磷酸化。此外，Genistein還能抑制氧化應(yīng)激狀態(tài)下促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，包括c-Jun氨基末端激酶(JNK)和細(xì)胞外信號相關(guān)激酶(ERK)。這些結(jié)果表明，Genistein可通過減少細(xì)

6、胞內(nèi)ROS生成、調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白和抑制ROS誘導(dǎo)的NF-κB及MAPK信號通路激活，有效地對抗氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　3.以兩種大豆材料北豐17(Beifeng17)和ZYD4368作為實(shí)驗(yàn)材料，克隆了大豆異黃酮合酶IFS1和IFS2兩種亞型的cDNA序列。構(gòu)建pMDC83-Beifeng17IFS1、pMDC83-ZYD4368IFS1、pMDC83-Beifeng17IFS2和pMDC83-ZYD4368IFS2

7、四種過表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌侵染的方法，遺傳轉(zhuǎn)化模式植物煙草。經(jīng)PCR鑒定，共獲得轉(zhuǎn)基因植株128株，總陽性率達(dá)87.1％。采用實(shí)時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因煙草中目的基因的表達(dá)情況及拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，葉片中IFS1基因表達(dá)量在6-50之間，含1-9個拷貝數(shù);IFS2基因表達(dá)量為2-25，含1-7個拷貝數(shù)。轉(zhuǎn)基因煙草花瓣中兩種基因的表達(dá)與葉片中相比無顯著差異。采用高效液相色譜(HPLC)方法檢測轉(zhuǎn)基因植抹中Genistein含量。在所有檢測

8、花瓣樣品中均觀察到Genistein積累，其中轉(zhuǎn)IFS1植株Genistein含量為5.41-6.28μg/g鮮重，轉(zhuǎn)IFS2植株Genistein含量達(dá)19.65-23.7μg/g鮮重。在葉片中，共檢測到6株轉(zhuǎn)基因煙草含Genistein。其中轉(zhuǎn)Beifeng17IFS22株(3.06μg/g鮮重和6.27μg/g鮮重)，轉(zhuǎn)ZYD4368IFS24株（3.31-18.78μg/g鮮重），而在兩種轉(zhuǎn)IFS1煙草葉片中未檢測到Genist

9、ein積累。在營養(yǎng)生長期間，野生型和轉(zhuǎn)基因煙草的表型無明顯差別。但在生殖生長時期，我們觀察到多株轉(zhuǎn)基因植株花色變淡的現(xiàn)象。以上結(jié)果表明，IFS2基因在Genistein合成途徑中發(fā)揮更為關(guān)鍵的作用，轉(zhuǎn)基因煙草花中Genistein含量及表達(dá)的穩(wěn)定性顯著高于葉片。進(jìn)一步對影響Genistein合成的關(guān)鍵遺傳因素進(jìn)行調(diào)控，增加其含量，作為可能的植物生物反應(yīng)器應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。
　　綜上所述，大豆異黃酮Genistein具有良好的腦保護(hù)