中山、廣州及西安地區(qū)幾種尸食性蠅類快速分子學(xué)鑒定.pdf

1、法醫(yī)昆蟲學(xué)主要是根據(jù)案發(fā)現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)的昆蟲提供破案線索的一門學(xué)科。最早記載的法醫(yī)昆蟲學(xué)案例報道出自我國宋代驗尸官宋慈的《洗冤集錄》。刑事死亡案件的偵破有賴于死亡時間迅速而精確的推斷，就法醫(yī)昆蟲學(xué)方法而言，死亡時間的準確推斷則需要對昆蟲種類進行快速而準確地鑒定。 但是，對死亡時間推斷有價值的主要是卵、幼蟲、蛹等幼期的蟲態(tài)，雖然對于成蟲的鑒定在世界范圍已經(jīng)不成問題，但幼期的昆蟲的鑒定則比較困難，有時甚至是不可能的。將這些幼期的昆蟲飼養(yǎng)到

2、成蟲則勢必耽擱時間，如果是死的昆蟲則無法飼養(yǎng)。 國內(nèi)外的研究表明，線粒體DNA細胞色素氧化酶基因的I和II亞基可用于昆蟲種類的鑒別。有鑒于此，我們開展了本研究。 材料與方法： 樣本分別采集于中山市、西安市和廣州市。其中中山市標本系用豬尸體進行野外死亡現(xiàn)場模擬試驗來收集得到，西安地區(qū)種類是用與中山市相同的方法在兔子尸體上收集得到。廣州市標本系用豬肝引誘成蠅產(chǎn)卵然后室溫飼養(yǎng)得到。 DNA提取干樣本DNA參照L

3、ambkin.C.L等使用的方法提取，并稍作修改。新鮮和乙醇保存樣本采用常規(guī)DNA提取方法提取。 擴增和測序引用Sperling等文章中的引物CO-I2f和CO-I3r，擴增線粒體COI基因348bp大小片段。所有的樣本均用正反向引物雙向測序。 限制性位點預(yù)測和限制性分析用DNASTAR軟件分析序列上限制性內(nèi)切酶切割位點。 PCR產(chǎn)物用DdeI，Drfl和HinfI消化，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色。

4、 計算機軟件分析MEGA3.0軟件進行分子進化樹及各個種類分子遺傳距離的分析。 結(jié)果： 形態(tài)學(xué)種類鑒定樣本經(jīng)相關(guān)昆蟲分類學(xué)專家鑒定，確定分別來自麗蠅科的四個屬和蠅科。其中中山及廣州地區(qū)包括四個種，分別為緋顏裸金蠅、大頭金蠅、絲光綠蠅和厚環(huán)黑蠅，西安地區(qū)為三個麗蠅科種類，分別為大頭金蠅、絲光綠蠅和巨尾阿麗蠅。 COI擴增及測序所有樣本均被測序，序列數(shù)據(jù)已被GenBank數(shù)據(jù)庫收錄。 限制性酶切分析分析樣本

5、COI基因位點(包括引物序列)348bp大小的核酸序列，這些片段用三種限制性內(nèi)切酶消化切割。中山和西安地區(qū)的大頭金蠅酶切片斷完全相同，但是兩市的絲光綠蠅被DdeI和HinfI切割成不同大小的片段，厚環(huán)黑蠅序列上無DdeI和HinfI切割位點，而DraI和HinfI在巨尾阿麗蠅序列上無切割點。 COI序列分析測序的結(jié)果也可以使我們得到有關(guān)分子遺傳的信息。每個地區(qū)的各個種類選1-3個樣本進行測序，五個種類所有個體的DNA序列進行比較

6、。巨尾阿麗蠅的兩個樣本的COI序列完全相同，而大頭金蠅(中山)2、3號和大頭金蠅(西安)2號樣本COI序列也完全相同，其余種類的序列彼此都不相同。大頭金蠅和厚環(huán)黑蠅之間分歧率最高，為每348個堿基14％，麗蠅科大頭金蠅和絲光綠蠅之間的變異率為6.7％，是兩個不同種類之間變異率最低的。 MEGA3.0軟件對序列數(shù)據(jù)進行了分析，分別用鄰接法和UPGMA法構(gòu)建了兩種分子進化樹，兩種進化樹的結(jié)果相同，均支持我們的形態(tài)學(xué)分類結(jié)果。進化樹在

7、DNA序列數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上形成了五個明顯的同種簇。Bootstrap評估為隨機重新分配的樣本數(shù)據(jù)的分組提供了一個可信度比率，本實驗中五個種類在種的水平上均形成了Bootstrap支持率為100％的單個簇。然而西安地區(qū)的絲光綠蠅與廣東省廣州市和中山市的絲光綠蠅之間有相當大的變異。 討論在COI基因348bp大小的片段上，用三種不同的限制性內(nèi)切酶區(qū)別本實驗五個不同的種類是可行的。中山地區(qū)與西安地區(qū)的大頭金蠅用這三種內(nèi)切酶很難區(qū)別開來，因

8、為其種內(nèi)變異很小，無地區(qū)差異；而廣東中山和廣州兩地與西安地區(qū)的絲光綠蠅則可用DdeI或HinfI鑒別出，其種內(nèi)變異在不同的地區(qū)表現(xiàn)明顯。用DdeI限制酶可鑒別出絲光綠蠅(中山，廣州)和厚環(huán)黑蠅，DraI限制酶可鑒別出厚環(huán)黑蠅和巨尾阿麗蠅，而HinfI可將緋顏裸金蠅和西安地區(qū)的絲光綠蠅與其他幾個種類鑒別開來。剩下的其他種類不能僅用一種限制性內(nèi)切酶將他們區(qū)別開，但是同時比對三種酶(DraI，DdeI和HinfI)切割的電泳圖譜即可將他們彼此

9、區(qū)別開。僅靠未消化切割的片段是不可能鑒別出任何種類的，因為在未知幼蟲出現(xiàn)的實際案例中，有可能會出現(xiàn)不包括在本研究中五個種類之內(nèi)的其他種類，它們的DNA也可以對同一種內(nèi)切酶保持未被消化狀態(tài)。 本研究用COI基因片段分析以及三種限制酶的消化，即可將西安地區(qū)最常見的三個麗蠅科種類和廣東中山與廣州兩地最常見的四個尸食性蠅的種類區(qū)別開來，各地區(qū)的種類間經(jīng)DdeI或HinfI限制酶切割后的片段大小各不相同，因此在廣東上述兩地或西安地區(qū)僅用其

10、中的一種限制酶就可以將其最常見的幾個種類鑒別出來。 本研究的五個種類之間的COI序列分歧相當?shù)停绕湓谙嗤N類之間。種間分歧比種內(nèi)分歧高，本研究各種類同種分組的高支持率，證明了將COI基因用于種間種類鑒別的潛力。本研究獲得的初步結(jié)果表明在廣東中山和廣州兩地與西安地區(qū)相同種類的個體之間存在少量的變異，特別是西安地區(qū)的絲光綠蠅表現(xiàn)出一定程度的變異，但是很難鑒別中山和西安地區(qū)大頭金蠅，因為兩地大頭金蠅該小片段COI基因的變異很低以至難

11、以表現(xiàn)出地區(qū)差異性。 目前研究的五個種類之間的COI序列是各不相同的，這表明基于COI序列的種類鑒定是可以實現(xiàn)的。用DNA序列鑒別未成熟階段雙翅目昆蟲的種類具有明顯快捷和簡便的優(yōu)勢，不但避免了使幼蟲發(fā)育為成蟲或發(fā)育到出現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)特征的等待時間，甚至在缺乏特殊形態(tài)特征的部分昆蟲殘體上也可以鑒別出其種類。 結(jié)論： 1.摸索出一種適用于昆蟲干標本的DNA提取方法，本方法較其他分子生物學(xué)方法更簡便快捷。 2.可