細(xì)菌信號(hào)AHL降解菌的篩選及其降解酶的研究.pdf

1、群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)是細(xì)菌進(jìn)行細(xì)胞間交流并通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)來協(xié)調(diào)群體行為的機(jī)制。?；呓z氨酸內(nèi)酯(Acyl-homoserine lactone，AHL)作為革蘭氏陰性細(xì)菌QS系統(tǒng)的一類主要的信號(hào)分子，參與調(diào)控抗生素合成，生物膜形成及毒力因子的表達(dá)等重要生物功能。研究表明，芽胞桿菌屬(Bacillus sp．)細(xì)菌產(chǎn)生的AHL內(nèi)酯酶AiiA能降解信號(hào)分子AHL，從而干擾病原菌QS系統(tǒng)的信號(hào)傳導(dǎo)而阻斷其致病

2、機(jī)制。在其他細(xì)菌以及真核生物中也存在不同類型的AHL降解酶。這些新的AHL降解酶的發(fā)現(xiàn)，將為病原菌的生物防治提供一個(gè)有效途徑。本研究的目的是利用實(shí)驗(yàn)室分離保存的豐富的微生物資源，從中篩選能高效降解AHL的菌株，并對(duì)其降解酶的特征進(jìn)行初步研究。 以根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的QS模式系統(tǒng)(1~aI/R．)為模型，用“96孔板液體檢測(cè)”和“瓊脂條檢測(cè)”法，從實(shí)驗(yàn)室保存的菌株中篩選到5個(gè)能高效降解

3、AHL的菌株Bt，ZS42， ZS91，ZSlO和ZSl5：其中Bt為蘇云金芽胞桿菌(B．thuringiensis)；ZS42，ZS91為番茄內(nèi)生細(xì)菌；ZSlO和ZSl5為動(dòng)物源性細(xì)菌。經(jīng)形態(tài)學(xué)和16S rDNA分析，初步鑒定ZS42和ZS91為芽胞桿菌屬細(xì)菌，ZSlO和ZSl5為蒼白桿菌屬(()chrobactrum sp．)細(xì)菌。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析顯示，各菌株的AHL降解活性均為胞內(nèi)的酶活性。對(duì)各菌株的抗病活性進(jìn)行分析j發(fā)現(xiàn)ZS42對(duì)

4、軟腐病菌歐文氏菌(帥inia carotovora．pv．cavotovora)SCGl的致病性有較強(qiáng)的抑制作用，Bt，ZS91能在一定程度上抑制軟腐病菌害，而ZSlO和ZSl5未表現(xiàn)出明顯的抗病活性。 為了進(jìn)一步研究降解酶的特征，根據(jù)已報(bào)道的AHL內(nèi)酯酶基因aiiA兩端序列設(shè)計(jì)引物，從Bt，ZS42，ZS91基因組DNA中分別克隆了aiiA基因。序列分析表明，所擴(kuò)增的3個(gè)基因片段大小均為753bp，和GenBank中已知的AH

5、L內(nèi)酯酶基因aiiA同源性達(dá)98﹪以上。推導(dǎo)得到的氨基酸序列中，均存在GloB保守結(jié)構(gòu)域，與已知AiiA一致。將aiiA基因插入到表達(dá)載體pET-17b，構(gòu)建融合表達(dá)載體pET-aiiA，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE檢測(cè)顯示AiiA在大腸桿菌BL21(DE3)得到高效表達(dá)，大小約為29KD，與理論值相符?；钚詸z測(cè)顯示，表達(dá)重組蛋白AiiA的大腸桿菌有較強(qiáng)的AHL降解活性。 目前僅有一