綠色木霉LTR-2 42kDa幾丁質(zhì)酶基因的克隆及轉(zhuǎn)基因番茄的構(gòu)建.pdf

1、番茄作為一種主要的經(jīng)濟(jì)作物和遺傳學(xué)上的模式生物，具有重要的研究?jī)r(jià)值，在植物基因工程研究上被廣泛利用。通過(guò)插入外源抗性基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因抗病番茄，是降低農(nóng)藥使用量和培育新優(yōu)良作物品種的有效途徑。幾丁質(zhì)酶(Chitinase)是一類細(xì)胞壁降解酶，普遍存在于各種動(dòng)物、植物和微生物中。利用幾丁質(zhì)酶編碼基因構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因植物能有效地抵抗多種病原菌。然而不同來(lái)源的幾丁質(zhì)酶抗病效果差異很大，因此發(fā)現(xiàn)一種合適的幾丁質(zhì)酶編碼基因?qū)τ跇?gòu)建轉(zhuǎn)基因抗病植物具有重要

2、意義。木霉作為一種重要的生防真菌，在其重寄生過(guò)程中產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶能夠降解多種病原微生物細(xì)胞壁。研究證實(shí)，在木霉產(chǎn)生的多種幾丁質(zhì)酶中，42kDa幾丁質(zhì)酶被認(rèn)為是降解病原菌細(xì)胞壁效果最好的一種。因此將木霉中的42kDa幾丁質(zhì)酶編碼基因整合到植物染色體中，獲得抗性植株是目前構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物研究的重要內(nèi)容之一。 綠色木霉LTR-2(Trichoderma virede)由本實(shí)驗(yàn)室從蔬菜植物根系土壤中篩選獲得，其制劑已經(jīng)獲得國(guó)家發(fā)明專利授權(quán)

3、，并已經(jīng)在農(nóng)業(yè)部登記注冊(cè)為新農(nóng)藥，對(duì)多種病原菌具有較好的拮抗作用，其作用機(jī)制之一就是產(chǎn)生多種細(xì)胞壁降解酶，尤其是42kDa幾丁質(zhì)酶。根據(jù)GenBank上已有的42kDa幾丁質(zhì)酶編碼基因序列設(shè)計(jì)適宜的引物，通過(guò)PCR技術(shù)，從綠色木霉LTR-2基因組DNh中擴(kuò)增到一段序列，測(cè)序結(jié)果表明，該編碼基因片段大小為1508bp，其中包括一個(gè)1459bp的開放閱讀框，起始密碼子位于45bp，終止密碼子位于1501bp，共編碼氨基酸424個(gè)。通過(guò)Gen

4、Bank進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列同已發(fā)表的其他Trichoderma Viride 42kDa幾丁質(zhì)酶氨基酸序列具有99％的同源性，因此確定該序列為42kDa幾丁質(zhì)酶編碼基因，該序列已在GenBank上登記(GenbankID：EF635427)。 將42kDa幾丁質(zhì)酶基因同質(zhì)粒pCAMBIA1300中的CaMV35S啟動(dòng)子和35S-polyA終止子連接后，插入植物表達(dá)載體pCAMBIA1302多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建成植物表達(dá)載體p