利拉魯肽對體外誘導的非酒精性脂肪肝細胞LC3Ⅱ、p62表達的影響.pdf

1、目的:通過觀察胰高血糖素樣肽-1（Glucagon-like peptide-1，GLP-1）受體激動劑利拉魯肽干預體外誘導的非酒精性脂肪肝細胞模型，檢測細胞自噬相關指標LC3Ⅱ、p62的變化，及細胞凋亡情況的變化，探討利拉魯肽對非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的治療作用效果及機制。
　　方法:用含10％胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM

2、培養(yǎng)液于體外培養(yǎng)人正常肝細胞-L02細胞，細胞培養(yǎng)基中加入油酸、棕櫚酸（2:1）誘導肝脂肪變性，建立NAFLD模型。細胞分組:1）正常對照組;2） NAFLD模型組；3）NAFLD模型組+利拉魯肽治療組+高脂培養(yǎng)液組:高脂培養(yǎng)液中加入濃度為10nmol/L利拉魯肽;4）NAFLD模型組+利拉魯肽治療組+正常培養(yǎng)液組:正常培養(yǎng)液中加入濃度為10nmol/L利拉魯肽;5）正常組+利拉魯肽:正常培養(yǎng)液中加入濃度為10nmol/L利拉魯肽；各組

3、分別干預48h，收集樣品。應用全自動生化儀檢測肝細胞中甘油三酯(Triglyceride,TG)的含量及上清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine Aminotransferase, ALT)的水平，試劑盒檢測丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）含量，采用油紅“O”染色法測定細胞內(nèi)脂滴情況。采用qRT-PCR檢測LC3Ⅱ、p62 mRNA的表達，Western

4、blot檢測微管相關蛋白1-輕鏈3(microtubule- associated protein1 light chain3,LC3)、真核細胞胞質(zhì)內(nèi)調(diào)控蛋白P62(sequestosome1,SQSTM1)蛋白表達的變化；采用TUNNEL分析法檢測細胞凋亡情況的變化。明確利拉魯肽改善人肝細胞系NAFLD模型療效的部分機制。數(shù)據(jù)分析：所得數(shù)據(jù)采用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均數(shù)±標準差表示。實驗數(shù)據(jù)均進行正態(tài)分布檢驗

5、及方差齊性檢驗，對于符合正態(tài)分布的采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，對于不符合正態(tài)分布的采用K-W秩和檢驗，以P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.利拉魯肽對正常L02細胞的TG、ALT、SOD、MDA水平、LC3Ⅱ、p62 mRNA和蛋白表達無明顯影響（P＞0.05）。
　　2.與正常對照組比較，NAFLD組細胞內(nèi)脂滴明顯增多，TG、ALT、MDA水平升高，SOD水平降低，LC3Ⅱ

6、mRNA和蛋白表達均降低，p62 mRNA蛋白表達增加，凋亡指數(shù)增加，差異均有顯著性（P＜0.05）。
　　3.與NAFLD細胞模型組比較，NAFLD細胞模型+利拉魯肽治療+高脂培養(yǎng)液組、NAFLD細胞模型+利拉魯肽治療+正常培養(yǎng)液組細胞內(nèi)脂滴明顯減少，TG、ALT、MDA水平下降，SOD水平明顯升高，LC3Ⅱ mRNA和蛋白表達均升高，p62 mRNA蛋白表達減少，凋亡指數(shù)下降，差異均有顯著性（P＜0.05）。
　　4.與

7、NAFLD細胞模型+利拉魯肽治療+正常培養(yǎng)液組比較，NAFLD細細胞胞模型+利拉魯肽治療+高脂培養(yǎng)液組內(nèi)脂滴減少幅度較低，TG、ALT、MDA水平下降幅度減少，SOD水平升高，LC3Ⅱ、p62 mRNA和蛋白表達、細胞凋亡指數(shù)水平改變幅度較低，差異均有顯著性(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.在體外成功建立非酒精性脂肪肝的細胞模型；
　　2.GLP-1受體激動劑利拉魯肽可減輕肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，改善肝細胞功能。