利拉魯肽對(duì)體外誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用.pdf

1、目的:通過觀察胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體激動(dòng)劑利拉魯肽干預(yù)治療體外誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)GRP78蛋白表達(dá)、ATF6核蛋白水平和caspase12的變化，探討利拉魯肽對(duì)NAFLD肝細(xì)胞抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用及細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　方法:
　　1.體外誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型：體外用含10％胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞，加入油酸、棕櫚酸（2:1）誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性

2、，建立非酒精性脂肪肝（NAFLD）細(xì)胞模型。
　　2.細(xì)胞分組及干預(yù)：1）正常對(duì)照組；2）NAFLD細(xì)胞模型組；3）NAFLD細(xì)胞模型+利拉魯肽+高脂培養(yǎng)液組：高脂培養(yǎng)液中加入濃度為10nmol/L利拉魯肽；4）NAFLD細(xì)胞模型+利拉魯肽+正常培養(yǎng)液組：正常培養(yǎng)液中加入濃度為10nmol/L利拉魯肽；5）正常細(xì)胞+利拉魯肽組：正常培養(yǎng)液中加入濃度為10nmol/L利拉魯肽；各組分別干預(yù)48h，收集樣品。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂肪含量與代謝水

3、平。
　　3.應(yīng)用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯（TG)的含量及上清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine Aminotransferase, ALT)，采用油紅“O”染色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)脂滴情況。
　　4.檢測(cè)氧化應(yīng)激有關(guān)的指標(biāo)MDA和SOD的水平。
　　5.采用qRT-PCR與Western blotting檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)GRP78蛋白表達(dá)以及下游ATF6核蛋白水平和細(xì)胞凋亡指標(biāo)caspase12的變化。
　

4、　6.采用TUNNEL分析法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化。
　　7.數(shù)據(jù)分析：所得數(shù)據(jù)采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，不符合正態(tài)分布的采用K-W秩和檢驗(yàn)。以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.利拉魯肽對(duì)正常L02細(xì)胞的TG、ALT水平、SOD活性、MDA含量、GRP78

5、、ATF6、caspase12mRNA和蛋白表達(dá)無明顯影響（P＞0.05）。
　　2.與正常對(duì)照組比較，NAFLD組細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增多，TG、ALT水平升高，SOD活性降低，MDA含量升高，GRP78、ATF6、caspase12 mRNA和蛋白表達(dá)均增高，凋亡指數(shù)增加，差異均有顯著性（P＜0.05）。
　　3.與NAFLD細(xì)胞模型組比較，NAFLD細(xì)胞模型+利拉魯肽治療+高脂培養(yǎng)液組、NAFLD細(xì)胞模型+利拉魯肽治療+正常

6、培養(yǎng)液組細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯減少，TG、ALT水平下降，SOD活性升高，MDA含量降低，GRP78、ATF6、caspase12 mRNA和蛋白表達(dá)減少，凋亡指數(shù)下降，差異均有顯著性（P＜0.05）。
　　4.與NAFLD細(xì)胞模型+利拉魯肽治療+正常培養(yǎng)液組比較，NAFLD細(xì)細(xì)胞胞模型+利拉魯肽治療+高脂培養(yǎng)液組內(nèi)脂滴減少幅度較低，TG、ALT水平下降幅度減少，SOD活性上升幅度降低，MDA含量下降幅度減少，GRP78、ATF6、cas

7、pase12 mRNA和蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡指數(shù)水平下降幅度較低，差異均有顯著性（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.高脂環(huán)境下，肝細(xì)胞凋亡的增加，而利拉魯肽可以對(duì)抗肝細(xì)胞凋亡。
　　2.GLP-1受體激動(dòng)劑利拉魯肽可減輕肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，改善肝細(xì)胞功能。
　　3.GLP-1受體激動(dòng)劑利拉魯肽可能通過下調(diào)GRP78、ATF6核蛋白的表達(dá)減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而使caspase-12的表達(dá)減少抑制肝細(xì)胞凋