靶向抑制EGFR信號通路治療骨巨細(xì)胞瘤的機(jī)制研究.pdf

1、骨巨細(xì)胞瘤（Giant cell tumor of bone，簡稱GCTB）是一種具有侵襲性呈膨脹性生長，并且以溶骨性破壞為主要特點(diǎn)的良性骨腫瘤，大約占所有原發(fā)骨腫瘤的5％左右。骨巨細(xì)胞瘤主要有三種細(xì)胞成分構(gòu)成:破骨細(xì)胞樣多核巨細(xì)胞，單核梭狀基質(zhì)細(xì)胞和圓形的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞來源的單核細(xì)胞。骨巨細(xì)胞瘤的發(fā)病和復(fù)發(fā)機(jī)制至今仍不清楚，由于少部分骨巨細(xì)胞瘤有惡變或轉(zhuǎn)移的潛能，其生物學(xué)行為及預(yù)后目前難以預(yù)測。研究表明基質(zhì)細(xì)胞能吸引和促進(jìn)單核-巨

2、噬細(xì)胞分化形成多核巨細(xì)胞，因此目前多認(rèn)為基質(zhì)細(xì)胞是致瘤的重要因素。骨巨細(xì)胞瘤的治療當(dāng)前仍以手術(shù)治療為主，手術(shù)切除的方式主要包括:瘤內(nèi)刮除術(shù)、外科邊緣病灶切除術(shù)以及En-bloc整塊切除術(shù)。盡管完整的手術(shù)切除腫瘤聯(lián)合雙膦酸鹽的輔助治療能明顯降低骨巨細(xì)胞瘤的局部復(fù)發(fā)率，但目前報道的27％-65％的局部復(fù)發(fā)率仍不容樂觀。除去手術(shù)治療，骨巨細(xì)胞瘤對化療放療均不敏感，這使得當(dāng)腫瘤因?yàn)榻馄饰恢谩⑦h(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、累及多個節(jié)段以及功能要求，難以獲得滿意的切除

3、時，缺乏行之有效的輔助治療手段。目前主要的藥物治療有雙膦酸鹽和狄諾塞麥，兩者均以抑制破骨細(xì)胞樣多核巨細(xì)胞引起的的骨吸收來發(fā)揮治療作用。對于致瘤的基質(zhì)細(xì)胞，兩者均無直接或間接的作用，因而這些治療很難避免腫瘤局部的再次復(fù)發(fā)。此外，骨巨細(xì)胞瘤多伴有豐富的血供和大量的血管新生，臨床上約有10-14％的骨巨細(xì)胞瘤伴有動脈瘤樣骨囊腫的形成。因此若能找到同時抑制多核巨細(xì)胞的分化形成和基質(zhì)細(xì)胞瘤的增殖，并能抑制血管新生的全新治療方法，將能更加有效地控制

4、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
　　EGFR是一個170kDa的具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，為erbB(HER)家族成員，又稱為erbB1/HER1，主要由胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ECD，621個氨基酸）、跨膜親脂結(jié)構(gòu)域（TM，23個氨基酸）、胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域（542個氨基酸）構(gòu)成。受體EGFR識別并結(jié)合胞外配體后，發(fā)生二聚化和磷酸化，并激活下游的Ras-MAPK信號通路、PI3K-AKT-mTOR信號通路、Src-JAK-STAT

5、s信號通路和PLCγ-PKC信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的周期進(jìn)程、增殖、凋亡、遷移等活動。EGFR過表達(dá)、突變或過度激活將持續(xù)激活下游信號通路，引起細(xì)胞異常增殖，血管新生和發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有相關(guān)文獻(xiàn)研究表明EGFR信號通路在GCTB疾病的發(fā)生發(fā)展中起著舉足輕重的作用，其在基質(zhì)細(xì)胞的增殖，破骨細(xì)胞的形成上可能起著重要的調(diào)控作用。這提示著EGFR信號通路是一個潛在的極具價值的骨巨細(xì)胞瘤治療靶點(diǎn)。
　　目的:
　　（一）對

6、比GCTB腫瘤細(xì)胞與正常人間充質(zhì)干細(xì)胞以及GCTB腫瘤標(biāo)本與正常人松質(zhì)骨中EGFR信號通路中重要的磷酸化蛋白表達(dá)差異。
　?。ǘ┯^察特異性阻斷EGFR信號通路對于GCTB多核巨細(xì)胞的形成、分化的影響。
　　（三）觀察特異性阻斷EGFR信號通路對于GCTB基質(zhì)細(xì)胞增殖或凋亡的影響。
　?。ㄋ模┯^察特異性阻斷EGFR信號通路對GCTB條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的形成的影響;探索GCTB基質(zhì)細(xì)胞調(diào)控破骨細(xì)胞成熟的機(jī)制和EGF

7、R信號通路調(diào)控破骨細(xì)胞分化形成的時間窗。
　?。ㄎ澹┯^察特異性阻斷EGFR信號通路對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖、遷移以及對GCTB基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的血管新生的影響。
　　（六）利用動物模型觀察特異性阻斷EGFR信號通路在體內(nèi)對GCTB治療的效果。
　　方法:
　?。ㄒ唬?yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)對比GCTB腫瘤細(xì)胞與正常人間充質(zhì)干細(xì)胞以及GCTB腫瘤標(biāo)本與正常人松質(zhì)骨中EGFR信號通

8、路中重要的磷酸化蛋白表達(dá)差異。
　　（二）應(yīng)用TRAP染色實(shí)驗(yàn)、PCR實(shí)驗(yàn)以及骨片實(shí)驗(yàn)觀察使用酪氨酸激酶抑制劑靶向阻斷EGFR信號通路后對GCTB多核巨細(xì)胞的形成及分化的影響。
　?。ㄈ?yīng)用熒光染色實(shí)驗(yàn)觀察特異性阻斷EGFR信號通路對GCTB基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察其對基質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　（四）應(yīng)用TRAP染色實(shí)驗(yàn)及PCR實(shí)驗(yàn)明確特異性阻斷EGFR信號通路對GCTB條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的形成、分

9、化的影響及機(jī)制。
　　（五）應(yīng)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、血管新生實(shí)驗(yàn)觀察EGFR信號通路在HUVECs增殖、遷移以及對GCTB基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的血管新生的影響作用。
　?。┩ㄟ^脛骨原位注射荷瘤構(gòu)建GCTB小鼠動物模型，給予酪氨酸激酶抑制劑Gefitinib靶向抑制EGFR信號通路，觀察其在體內(nèi)對GCTB溶骨破壞的治療效果;通過雞胚絨毛尿囊膜荷瘤模型，觀察不同濃度Gefitinib靶

10、向抑制EGFR信號通路后成瘤的效果。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬〨CTB腫瘤標(biāo)本及原代細(xì)胞中EGFR信號通路異常激活。
　?。ǘ┪覀兝美野彼峒っ敢种苿┌邢蜃钄郋GFR信號通路后，GCTB多核巨細(xì)胞形成以及分化受到明顯抑制，其導(dǎo)致的局部溶骨破壞也被有效抑制，并呈藥物劑量依賴性;隨著藥物濃度上升RANKL的表達(dá)減弱，而OPG的表達(dá)增強(qiáng)。
　?。ㄈ┨禺愋宰钄郋GFR信號通路能有效抑制GCTB基質(zhì)細(xì)胞的增殖，但對基質(zhì)細(xì)

11、胞的凋亡無明顯影響。
　?。ㄋ模┨禺愋宰钄郋GFR信號通路能有效抑制GCTB條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的形成;EGFR信號通路主要在破骨細(xì)胞形成的早期階段起調(diào)控作用;基質(zhì)細(xì)胞的EGFR信號通路被阻斷后，其分泌的細(xì)胞因子:NFATc1、TRAP、MMP9、M-CSF、MCP-1、SDF-1表達(dá)水平明顯下降。
　?。ㄎ澹┳钄郋GFR信號通路能有效抑制HUVECs的增殖、遷移以及基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的血管新生。
　?。┞?/p>

12、鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:阻斷EGFR信號通路能有效地抑制GCTB局部的溶骨破壞，Gefitinib在裸鼠體內(nèi)無明顯毒副作用;雞胚絨毛尿膜囊荷瘤實(shí)驗(yàn)顯示:當(dāng)Gefitinib濃度達(dá)到10μM，雞胚絨毛尿囊膜上無法成瘤。
　　結(jié)論:
　　本研究中我們通過蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)和免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了EGFR信號通路在GCTB中呈異常高表達(dá)狀態(tài)。通過應(yīng)用EGFR小分子化合物抑制劑靶向阻斷EGFR信號通路，觀察到破骨細(xì)胞樣多核巨細(xì)胞的形成以及基

13、質(zhì)細(xì)胞的增殖和對單核細(xì)胞的趨化募集作用受到明顯抑制;由基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及血管新生也得到有效地控制;在小鼠動物模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，抑制EGFR能有效阻止腫瘤對骨結(jié)構(gòu)的溶骨破壞，且無明顯毒副作用;雞胚絨毛尿膜囊荷瘤實(shí)驗(yàn)顯示，抑制EGFR信號通路能阻止GCTB的成瘤和血管新生。這一研究結(jié)果提示著EGFR信號通路在GCTB的發(fā)生發(fā)展中起到重要的調(diào)控作用。目前EGFR靶向抑制劑已在多種惡性腫瘤的臨床治療中得到應(yīng)用，我們期待在不久的將