TNF-α在圍生期大鼠肝內(nèi)表達(dá)特征的初步研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  膽道閉鎖(biliary atresia,BA)是引起新生兒阻塞性黃疸最常見的原因之一,其與自發(fā)性新生兒肝炎(INC)共占新生兒膽汁淤積性疾病的50%~70%。膽道閉鎖在亞洲人群中發(fā)病率約為1/8000,在歐洲人群中發(fā)病率約為1/18000,女嬰發(fā)病數(shù)量較多。其特征性病變是患兒在3個月內(nèi)即出現(xiàn)全部或部分肝外膽管系統(tǒng)進行性纖維化閉塞,同時伴肝內(nèi)膽管損傷及肝纖維化。臨床表現(xiàn)為阻塞性黃疸、白陶土大便、肝脾大三聯(lián)征,同時實驗室

2、檢查膽紅素及轉(zhuǎn)氨酶升高,且進展迅速。
  膽道閉鎖病因未明,一般認(rèn)為其發(fā)病機制涉及病毒感染、自身免疫介導(dǎo)的膽管破壞及膽道發(fā)育異常。20世紀(jì)90年以來,隨著研究深入,由圍生期病毒感染激發(fā)的免疫炎癥反應(yīng)在BA的發(fā)生中起重要作用,尤其是病毒感染所引發(fā)的進行性纖維化病變是膽道閉鎖發(fā)生的重要原因之一。由病毒抗原激活的特異性T細(xì)胞通過γ干擾素(IFN-γ)刺激巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮、氧代謝物質(zhì)和腫瘤壞死因子(TNF),能特異性破壞膽管上皮細(xì)胞,

3、引起細(xì)胞壞死和凋亡,即使病毒被清除,膽管上皮細(xì)胞炎癥和損傷仍持續(xù)存在,并最終導(dǎo)致肝外膽管的纖維化和梗阻。
  目前已有動物實驗研究證明,圍生期的小鼠經(jīng)過腹腔內(nèi)注射感染輪狀病毒可以形成類似于膽道閉鎖的動物模型,而在其他時間內(nèi)感染并不會造成新生鼠膽汁淤積和膽道閉鎖發(fā)生,這可以說明圍生期的免疫系統(tǒng)發(fā)育具有一定的特殊性。
  本研究擬對圍生期內(nèi)巨噬細(xì)胞及其分泌的腫瘤壞死因子的表達(dá)情況進行分析,進一步了解這一特殊時期小鼠易患膽道閉鎖的

4、機制。
  方法:
  一、標(biāo)本制備
  Wistar孕鼠取孕17-21天(E17-21)的Wistar大鼠胎鼠及出生0-5天(N0-N5)的新生鼠,取出胎鼠及新生鼠的肝臟,其中E17、E19、N1、N3每組各取5個標(biāo)本固定于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中,常規(guī)脫水,石蠟包埋,制成蠟塊。其余保存于-80℃冰箱中,用于Western blot及RT-PCR檢測。
  二、實驗方法
  1、Western blot

5、及RT-PCR:冰凍標(biāo)本中提取總蛋白及總RNA,通過Westernblot及RT-PCR方法檢測各年齡組腫瘤壞死因子(TNF-α)及巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記物F4/80在圍生期各個時間點的表達(dá)情況。
  2、免疫組織化學(xué)方法:石蠟標(biāo)本連續(xù)切片,厚度4μm,應(yīng)用免疫組化方法染色分別檢測F4/80及TNF-α表達(dá)情況。采用NIS-Elements Basic Research多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)對F4/80及TNF-α表達(dá)進行觀察,并

6、分析判斷陽性細(xì)胞的總體趨勢。
  三、數(shù)據(jù)分析
  所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析,數(shù)值比較采用t檢驗分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
  結(jié)果:
  一、Western blot結(jié)果
  TNF-α的蛋白量在E17-E20時水平較高,在出生前逐漸降低,中間略有波動,N0-N2時降至最低,之后又逐漸上升,N5時升至最高。F4/80的蛋白量變化與TNF-

7、α相似,同樣是出生前逐漸降低,在N0-N2時降至最低,后又逐漸上升,N5時達(dá)到最高。
  二、RT-PCR結(jié)果
  TNF-α mRNA水平在產(chǎn)前至N0水平相對較高,出生后迅速降低,N1-N4時降至最低,之后又逐漸上升。F4/80 mRNA的表達(dá)同樣在出生前逐漸下降,N0-N2時降至最低,之后又逐漸上升,N5時升至最高。
  三、免疫組化染色結(jié)果
  TNF-α的陽性表達(dá)的平均光密度在E19天(0.1724±0.

8、021)及N1天時(0.1656±0.017)表達(dá)較少,而在E17天(0.1938±0.025)及N3天(0.1952±0.021)時的陽性表達(dá)相對略多。巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80同樣是在E19天(0.1891±0.018)及N1天時(0.1868±0.020)表達(dá)較少,而在E17天(0.1919±0.024)及N3天(0.1947±0.027)時的陽性表達(dá)相對略多。P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
  結(jié)論:
  TNF-α

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