脂聯(lián)素在原核系統(tǒng)中的表達(dá)及其抑瘤活性研究.pdf

1、肥胖是全球的公共健康問題，肥胖與多種血管形成有關(guān)的疾病相關(guān)聯(lián)，如糖尿病、心血管疾病和癌癥。脂肪組織不僅用于貯存能量而且具有重要的內(nèi)分泌功能，脂肪組織分泌多種活性多肽統(tǒng)稱為脂肪細(xì)胞因子。脂聯(lián)素(ACRP30，ADIPOQ，apM1基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)是近期發(fā)現(xiàn)的由脂肪細(xì)胞分泌的蛋白，具有抗糖尿病、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。在有胰島素抵抗和高胰島素血癥如向心性肥胖和2型糖尿病情況下，循環(huán)中脂聯(lián)素水平下降。 近期有研究發(fā)現(xiàn)低脂聯(lián)素水平可增加多種

2、癌癥發(fā)生的危險(xiǎn)性。有體外實(shí)驗(yàn)研究表明，脂聯(lián)素抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，通過雞絨毛膜尿囊膜和小鼠角膜血管形成的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素顯著抑制新生血管的形成，因此，研究認(rèn)為脂聯(lián)素是血管形成的負(fù)調(diào)節(jié)因子。另有研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素刺激體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分化成毛細(xì)管狀結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)刺激新生血管形成，因此，研究認(rèn)為脂聯(lián)素是血管形成的正調(diào)節(jié)因子。 由于目前關(guān)于脂聯(lián)素對(duì)血管形成和腫瘤形成的影響還缺乏足夠的證據(jù)，從事該研究的目的是為進(jìn)一步提

3、供這方面的研究資料，本研究主要解決以下兩方面的問題：1.克隆和表達(dá)全長(zhǎng)ACRP30蛋白及ACRP30球型結(jié)構(gòu)域蛋白，以得到純化的重組蛋白；2.重組ACRP30對(duì)細(xì)胞增殖和血管形成的影響。 本研究采用的方法：用TRIzol試劑從小鼠脂肪組織中提取總RNA，用小鼠ACRP30序列特異性引物經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出全長(zhǎng)ACRP30cDNA序列，將目的序列插入pGEM-T載體，目的序列經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)。實(shí)驗(yàn)采用原核系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白，用含B

4、amHⅠ的5’CTATATGGATCCGAAGATGACGTTAC3’作為上游引物，用含HindⅢ的5'GTAGTGAAGCTTTCAGTTGGTATCATG3’作為下游引物，擴(kuò)增出去除信號(hào)肽的693bp的小鼠ACRP30cDNA序列(18-247氨基酸)，目的片段經(jīng)BamHⅠ/HindⅢ雙酶切后亞克隆至pET-32(a)表達(dá)載體，重組質(zhì)粒命名為pET-ACRP30，編碼帶有Trx.tag和His6tag的全長(zhǎng)ACRP30融合蛋白。采用

5、5'TATATGGATCCGCCGCTTATGTGT3’作為上游引物，用同樣的方法構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-gACRP30，編碼含有Trx.tag和His6tag的ACRP30球型結(jié)構(gòu)域融合蛋白4(110-247氨基酸)。分別將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化OrigamiTM(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。裂解細(xì)菌，用Ni2+-NTAHis.Bind樹脂親和純化全長(zhǎng)ACRP30融合蛋白。蛋白經(jīng)透析除鹽，超濾濃縮，蛋白純度經(jīng)SDS-PAGE和HPLC

6、鑒定，用BCA試劑盒對(duì)蛋白定量后凍存于-80℃冰箱。 抑瘤活性研究分為兩部分：體外實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢驗(yàn)重組ACRP30對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF7增殖和活力的影響；用MTS法來檢驗(yàn)重組ACRP30對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用雞絨毛膜尿囊膜(CAM)實(shí)驗(yàn)探索ACRP30對(duì)血管形成的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：小鼠脂肪組織ACRP30基因編碼序列不同于來自3T3-L1脂肪細(xì)胞的編碼序列，IRM-2小鼠和C57BL/6J小鼠

7、的ACRP30基因編碼序列相同。337位點(diǎn)上的堿基A被G置換導(dǎo)致在113位的蛋氨酸被纈氨酸取代。來自脂肪組織的ACRP30基因編碼序列已被提交到GenBankTM數(shù)據(jù)庫(kù)，C57BL/6J小鼠的收錄編號(hào)為AY749429，IRM-2小鼠為AY754346。 重組質(zhì)粒pET-ACRP30或pET-gACRP30轉(zhuǎn)化OrigamiTM(DE3)表達(dá)宿主菌表達(dá)重組蛋白，全長(zhǎng)ACRP30主要以可溶形式表達(dá)，ACRP30球型結(jié)構(gòu)域以可溶形

8、式和包涵體兩種形式表達(dá)。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示全長(zhǎng)ACRP30及ACRP30球型結(jié)構(gòu)域蛋白表達(dá)量分別占菌體總蛋白的33％和34％，分子量分別為42KD和33KD，與預(yù)期分子量大小一致。全長(zhǎng)ACRP30融合蛋白經(jīng)組氨酸鎳螯合樹脂親和純化，洗脫后得到重組蛋白。 MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組ACRP30并不抑制體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞系MCF7增殖，但低濃度重組ACRP30可刺激體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。雞絨毛膜尿囊膜實(shí)驗(yàn)

9、表明，重組ACRP30在體內(nèi)刺激血管形成。 結(jié)論：1.IRM-2小鼠和C57BL/6J小鼠脂肪組織ACRP30基因編碼序列相同，在337位點(diǎn)上的堿基為G，相應(yīng)的113位點(diǎn)的氨基酸為纈氨酸。這一編碼序列與來自3T3-L1脂肪細(xì)胞的編碼序列不同，3T3-L1脂肪細(xì)胞ACRP30編碼序列在337位點(diǎn)上的堿基為A，相應(yīng)的113位點(diǎn)的氨基酸為蛋氨酸。2.重組ACRP30在10-2000ng/ml濃度范圍內(nèi)不能抑制體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞(