白細胞介素-37(IL-37)在人體外周血CD4+效應(yīng)T淋巴細胞中的表達及對其免疫功能的影響.pdf

1、目的:
　　1.探求白細胞介素-37(interleukin-37，IL-37)在人外周血CD4+效應(yīng)T細胞（effectorTcells）中的表達情況。
　　2.研究在脂多糖(LPS)刺激下，CD4+效應(yīng)T細胞活化程度與IL-37表達水平的時效關(guān)系。
　　3.證明IL-37可以抑制CD4+效應(yīng)T細胞發(fā)揮免疫效應(yīng)。
　　方法:
　　第一部分:分離健康志愿者外周血單個核細胞(PBMC)，采用免疫磁珠分選分選C

2、D4+T淋巴細胞，通過胎盤藍檢測細胞活性，應(yīng)用流式細胞技術(shù)檢測CD4+效應(yīng)T細胞純度。
　　1.增殖活性檢測:設(shè)置刺激劑組（脂多糖-LPS:1ug/ml）、陰性對照組（即無LPS刺激細胞組），通過CCK-8技術(shù)檢測不同分組之間CD4+T淋巴細胞增殖活性差異，得出刺激時間(24h、48h、72h)與細胞增殖活性時效關(guān)系。2.IL-37基因水平表達情況:通過PCR技術(shù)明確CD4+效應(yīng)T細胞中IL-37mRNA的表達。
　　3.I

3、L-37蛋白水平表達情況:分別通過Western blot技術(shù)和流式細胞技術(shù)檢測LPS刺激下，不同刺激時間下(24h、48h、72h)效應(yīng)T淋巴細胞中IL-37蛋白表達水平差異。
　　4.IL-37細胞內(nèi)表達定位:通過免疫熒光與激光掃描共聚焦技術(shù)檢測IL-37蛋白在效應(yīng)T淋巴細胞中表達情況，明確其表達位置。
　　第二部分:分離健康志愿者外周血單個核細胞(PBMC)，應(yīng)用免疫磁珠分選技術(shù)獲得CD4+效應(yīng)T細胞，應(yīng)用小分子干擾R

4、NA沉默效應(yīng)T細胞中IL-37的表達，另設(shè)置siRNA-scramble無效干擾細胞組、正常對照細胞組。
　　1.siRNA-IL-37蛋白水平抑制效果檢測:采用流式細胞技術(shù)檢測小分子干擾RNA對IL-37的沉默效果，對比siRNA-scramble干擾后效應(yīng)T細胞組、正常對照效應(yīng)T淋巴細胞在LPS刺激作用72h后，IL-37表達情況。
　　2.增殖活性檢測:采用CCK-8法檢測siRNA-scramble干擾后細胞組、正常

5、細胞組、siRNA-IL37干擾后細胞組在LPS刺激72h時的增殖活性。
　　3.通過流式細胞技術(shù)檢測siRNA-scramble干擾組、正常細胞組、siRNA-IL-37干擾組細胞中CD152表達情況。
　　4.細胞效應(yīng)因子檢測:采用Elisa技術(shù)，檢測正常對照細胞組、siRNA-IL37干擾后T細胞組細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-17水平的變化。
　　結(jié)果:
　　1.健康志愿者

6、外周血單個核細胞(PBMCs)經(jīng)過磁珠分選，應(yīng)用胎盤藍試劑染色檢測，細胞活性大于98％;應(yīng)用流式細胞儀檢測得到CD4+效應(yīng)T淋巴純度達99％。
　　2.應(yīng)用LPS刺激效應(yīng)T淋巴細胞激活，采用CCK-8法檢測不同時間段(24h、48h、72h)效應(yīng)T細胞增殖活性，結(jié)果顯示其在刺激達到72h時增殖活性最高。
　　3.通過PCR技術(shù)檢測，CD4+效應(yīng)T細胞中存在IL-37-mRNA的表達，且隨著LPS刺激作用時間的延長，IL-37

7、-mRNA表達水平逐漸升高。
　　4.Western blot結(jié)果顯示，CD4+效應(yīng)T細胞可表達IL-37蛋白;隨著LPS刺激作用時間的延長(24h、48h、72h)，CD4+效應(yīng)T細胞中IL-37蛋白表達水平逐漸升高(P＜0.05)。
　　5.通過流式細胞技術(shù)檢測，CD4+效應(yīng)T細胞表達IL-37蛋白，且隨著LPS刺激時間的延長(24h、48h、72h)，細胞中IL-37-FITC表達水平增高。
　　6.免疫熒光與激

8、光掃描共聚焦結(jié)果顯示，CD4+效應(yīng)T淋巴細胞中表達IL-37，可在細胞核、胞質(zhì)表達，以細胞核周圍表達最為豐富。
　　7.應(yīng)用流式細胞技術(shù)檢測各組細胞中CD152表達水平顯示，siRNA-IL-37干擾組效應(yīng)T細胞CD152表達水平較siRNA-scramble干擾組及正常細胞明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)
　　8.CCK-8檢測效應(yīng)T淋巴細胞增殖活性結(jié)果顯示，相比于siRNA-scramble干擾組及正常對照細胞

9、組，siRNA-IL-37細胞組在450nm波長處OD值明顯升高(P＜0.05)，表明該組效應(yīng)T細胞增殖活性升高;siRNA-scramble干擾組與正常效應(yīng)T細胞相比較，OD450值無明顯差異性(P＞0.05)，表明siRNA-scramble干擾組對效應(yīng)T淋巴細胞抑制效應(yīng)微弱，與正常組無明顯差異。
　　9.采用Elisa技術(shù)，檢測siRNA-IL-37沉默后效應(yīng)T淋巴細胞組及正常對照組細胞在LPS刺激作用培養(yǎng)下72h后，細胞培

10、養(yǎng)上清液中細胞因子IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ含量，結(jié)果表明siRNA-IL-37干擾后，四種細胞因子含量均有不同程度的升高，于正常組相比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，表明IL-37的表達可能影響CD4效應(yīng)T淋巴細胞炎性細胞因子的生成。
　　10.比較siRNA-IL-37干擾組及正常細胞組細胞培養(yǎng)液中IFN-γ/IL-4值，相對于正常對照組細胞，siRNA-IL-37干擾后細胞培養(yǎng)液中IFN-γ/IL-4比

11、值升高，但無顯著差異(P＞0.05)，本次實驗尚不能明確IL-37對效應(yīng)T細胞中Th1、Th2細胞極化趨勢的作用。
　　結(jié)論:
　　1.健康人體外周血CD4+效應(yīng)T淋巴能夠表達IL-37。
　　2.在炎癥環(huán)境刺激下，隨著IL-37的表達水平隨著效應(yīng)T淋巴細胞活化水平增高而升高，本實驗環(huán)境下，IL-37在細胞活性最強的72小時表達尤為明顯，并且IL-37蛋白表達水平與信使RNA時效性趨勢相同。
　　3.IL-37在