甲狀旁腺激素的非PLC依賴PKC通路對(duì)骨代謝的研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥是一類伴隨年齡衰老或醫(yī)學(xué)原因一起的，以骨量丟失、骨密度降低、骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加、骨強(qiáng)度下降，以及易于發(fā)生骨折為主要臨床特征的代謝性、全身性骨骼疾病。WHO于1994年制定了以骨密度測(cè)量為基礎(chǔ)，診斷骨質(zhì)疏松的標(biāo)準(zhǔn)為骨密度值低于或等于正常年輕人2.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差即可診斷為骨質(zhì)疏松，有過一次或多次骨折經(jīng)歷的都肯定有嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松。隨著全球人口的老齡化，骨質(zhì)疏松在全世界常見病、多發(fā)病中的地位逐漸上升至第七位。在我國(guó)骨質(zhì)疏松癥也

2、已躍居常見病第六位，患病人數(shù)已達(dá)到9500萬。其中50～60歲的發(fā)生率為21％，60～70歲的為58％，70歲以上幾乎是100％，尤以絕經(jīng)后婦女的發(fā)生率更高，據(jù)調(diào)查顯示，50歲以上男性及40歲以上女性都有不同程度的骨質(zhì)疏松，隨著年齡的增加，骨質(zhì)疏松的發(fā)生率明顯增加。健康人的骨密度（礦物質(zhì)含量）在30歲以前是上升的，并在30～39歲達(dá)到高峰，到40歲以后逐漸下降，礦物質(zhì)量下降往往沒有感覺或者感覺輕微，只有在減少12％以上時(shí)才會(huì)出現(xiàn)變矮、駝

3、背、彎腰等臨床癥狀，并且隨著年齡的增加和礦物質(zhì)含量的減少而加重。當(dāng)患者發(fā)生骨折時(shí)，此時(shí)的礦物質(zhì)含量丟失已達(dá)25％以上。目前治療骨質(zhì)疏松的主要方法分為飲食治療和藥物治療，通過調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)、補(bǔ)充鈣劑及維生素D等具有一定的治療效果。藥物治療主要分為抑制骨吸收藥物和促進(jìn)骨形成藥物，前者包括雌激素替代療法、降鈣素、維生素D及其代謝產(chǎn)物、二膦酸鹽、異黃酮衍生物等，后者有甲狀旁腺激素、氟化物、他汀類藥物、鈣劑、鍶鹽、男性激素治療等。在增加骨量促骨形成

4、的代謝藥物中，目前只有甲狀旁腺激素（商用名:特里帕肽）獲得認(rèn)可。甲狀旁腺激素對(duì)骨代謝具有獨(dú)特的作用，這是其它藥物所不具備的。這些作用主要包括增加骨密度、促進(jìn)骨微結(jié)構(gòu)的重塑以及降低骨折的發(fā)生率。
　　甲狀旁腺激素(PTH)是調(diào)節(jié)骨代謝的重要激素之一。改變?nèi)魏蔚鞍椎陌被嵝蛄谢蛘邩?gòu)象都會(huì)改變?cè)摰鞍椎哪芰Γ琍TH(1-34)也不例外，其構(gòu)象的改變及氨基酸序列的變化都有可能影響某些信號(hào)通路的激活能力。如:PTH(1-34)完整的N端結(jié)構(gòu)是

5、cAMP/PKA和PLC/PKC通路的激活的必要條件;Gly1替換Ser1可使PTH(1-34)失去激活PLC的特性;Arg19替換Glu19能夠補(bǔ)償因29-34氨基酸殘基缺失而引起的受體結(jié)合力減弱;當(dāng)Leu24，Leu28，val31突變成Glu后，PTH(5-34)不與受體結(jié)合;在PTH(1-14)的氨基酸殘基中，Val2，Glu4，Ile5，Lys7，Met8，His9突變成Ala后，不能激活cAMP/PKA信號(hào)通路;在PTH(1

6、-34)中，Ile5，Glu19，Val21等位點(diǎn)的突變，嚴(yán)重干擾PTH(1-34)與受體的結(jié)合力;Aib1，3，Nle8，21，Gln10，Har11，Ala12，Trp14，Arg19構(gòu)成的組合突變亦稱M突變，M突變可使PTH(1-14) cAMP的合成能力提高約40倍，PLC的激活能力提高66倍，與PTHR的結(jié)合力提高約10倍;[Nle8，18，Tyr34]PTH(3-34)可使PTH(3-34)擁有激活cAMP/PKA通路的能力

7、，但仍遠(yuǎn)小于(10倍以上)PTH(1-34)激活cAMP的能力等;基于以上PTH模擬肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，通過利用PKC激活的熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)，即通過加入不同的信號(hào)通路阻滯劑以及不同信號(hào)通路的模擬肽改變信號(hào)通路來觀察FRET效率以及青色熒光與黃色熒光強(qiáng)度的比值（C/Y）是否改變以及改變的強(qiáng)度，以此來判斷是否激活PKC。本課題組于近年設(shè)計(jì)和篩選出具有nonPLC/PKC通路特異性PTH模擬肽（簡(jiǎn)稱MY1肽）。該MY1肽具有PTH/

8、nonPLC/PKC的激活能力，即1）MY1肽激活PKC是與PTHR結(jié)合后通過PTH/nonPLC/PKC通路實(shí)現(xiàn)的并且不依賴于cAMP和PLC信號(hào)通路的激活。2）PTH/nonPLC/PKC模擬肽MT1肽具有顯著增強(qiáng)成骨相關(guān)基因CITED1及ALP的作用。
　　我們前期的研究揭示:PTH經(jīng)nonPLC/PKC通路促進(jìn)受力區(qū)松質(zhì)骨合成，促進(jìn)新骨形成，但是nonPLC/PKC通路的具體信號(hào)中介分子仍不清楚，相應(yīng)的影響骨代謝的機(jī)理還需

9、要深入研究。最近研究發(fā)現(xiàn)，PTH短時(shí)間（1小時(shí)）刺激引起的細(xì)胞增值主要是由PKA通路主導(dǎo)的，而PKC通路主要參與PTH的長(zhǎng)時(shí)間(24和48小時(shí))的刺激從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖的減少和凋亡的增加。但是對(duì)于PTH/nonPLC/PKC信號(hào)通路對(duì)于細(xì)胞的增殖與凋亡目前尚不清楚。既往本課題組通過注射PTH(1-34)與G1R19(1-34)對(duì)去勢(shì)小鼠骨折愈合的影響發(fā)現(xiàn):發(fā)現(xiàn)PTH(1-34)和G1R19(1-34)組骨密度明顯高于G1R19(1-28)

10、組且G1R19(1-34)組的骨小梁重建速度比G1R19(1-28)組更快，也就是PTH/nonPLC/PKC通路具有改善骨小梁結(jié)構(gòu)和增加受力區(qū)松質(zhì)骨骨量的效應(yīng)?；赑TH的基本結(jié)構(gòu)，我們?cè)O(shè)計(jì)和篩選了不依賴PKA及PLC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的特異性PTH/nonPLC/PKC信號(hào)通路選擇性模擬肽MY1肽，利用MY1肽干預(yù)去睪丸小鼠股骨骨折的進(jìn)程以及對(duì)比其與PTH(1-34)對(duì)股骨骨折的愈合以及對(duì)骨質(zhì)疏松骨代謝的差異，觀察該信號(hào)通路特異性模擬肽MY1

11、肽對(duì)于骨折愈合和骨質(zhì)疏松骨代謝的影響，通過分析脛骨骨松質(zhì)及骨皮質(zhì)和股骨骨折端骨痂區(qū)的差異，進(jìn)一步明確PTH/nonPLC/PKC通路對(duì)骨代謝的影響。
　　目的:
　　1.觀察甲狀旁腺激素的非依賴PLC的PKC轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(PTH/nonPLC/PKC)是否會(huì)對(duì)成骨細(xì)胞(MC3T3E1)的凋亡以及細(xì)胞數(shù)量的影響。
　　2.在顯微CT上分析特異性PTH/nonPLC/PKC模擬肽對(duì)去勢(shì)骨折小鼠的脛骨骨小梁、骨皮質(zhì)的影響及股骨骨

12、折的愈合情況，進(jìn)一步了解nonPLC/PKC通路對(duì)骨代謝的影響。
　　方法:
　　培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞，以1.5×104密度接種到96孔板，然后置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天直到細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài)，隨機(jī)分為5組:100nmol/LG1R19hPTH(1-28)組;100nmol/LG1R19hPTH(1-34)組;100nmol/LG1R19hPTH(1-34)+1μmol/L Go6983組，1μmol/LGo6983組;空白對(duì)照組

13、加入等體積的0.1％TFA(TFA為甲狀旁腺激素模擬肽的溶劑)，分別刺激細(xì)胞1小時(shí)，24小時(shí)，48小時(shí)，然后使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)和Caspase-Glo(R)3/7試劑盒(Caspase-3)檢測(cè)細(xì)胞的數(shù)量及凋亡情況。
　　結(jié)果:
　　通過分析細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)，結(jié)果顯示G1R19(1-34)組與G1R19(1-34)+Go6983組相比，在1小時(shí)及24小時(shí)具有提高細(xì)胞數(shù)量的趨勢(shì)，但結(jié)果沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，

14、48小時(shí)G1R19(1-34)組與G1R19(1-28)組相比，可以明顯提高細(xì)胞的數(shù)量(P＜0.05)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在G1R19(1-34)組添加抑制劑Go6983后，細(xì)胞數(shù)量增多的效應(yīng)消失(P＜0.05)。Caspase-Glo(R)3/7試劑盒結(jié)果顯示，G1R19(1-34)組與G1R19(1-34)+Go6983組相比，在1小時(shí)及24小時(shí)具有抑制細(xì)胞凋亡，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。48小時(shí)檢測(cè)凋亡顯示，G1R19(1-34)組與G

15、1R19(1-28)組相比，前者可以明顯抑制細(xì)胞的凋亡(P＜0.05)，給予PKC抑制劑Go6983后，這種抑制凋亡的現(xiàn)象消失。
　　通過切除小鼠睪丸，制造骨質(zhì)疏松模型，1周后再次進(jìn)行手術(shù)橫切股骨中段，造成骨質(zhì)疏松股骨骨折模型。藥物刺激2周及4周后，處死小鼠，血清學(xué)檢測(cè)分析顯示，MY1肽組與空白對(duì)照組相比，鈣離子及ALP明顯升高并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。顯微CT分析得，在2周及4周時(shí)，MY1肽組與空白對(duì)照組相比，其具有改

16、善骨小梁結(jié)構(gòu)并且提高骨小梁的骨密度及骨量，同時(shí)也會(huì)提高脛骨骨皮質(zhì)周徑并且能夠促進(jìn)骨折的愈合。
　　結(jié)論:
　　1.初步發(fā)現(xiàn)PTH的nonPLC/PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能在長(zhǎng)時(shí)間（48小時(shí)）作用于MC3T3-E1細(xì)胞時(shí)，會(huì)抑制成骨細(xì)胞，增加成骨細(xì)胞數(shù)量。這有益于我們加深對(duì)PTH/nonPLC/PKC通路的理解，并為甲狀旁腺激素對(duì)骨質(zhì)疏松的治療增添了新的研究方向。
　　2.nonPLC/PKC通路具有改善骨小梁結(jié)構(gòu)且促進(jìn)受力