甲基丙二酸血癥基因新突變功能及神經(jīng)元凋亡機制研究.pdf

1、第一部分甲基丙二酰輔酶A變位酶基因新錯義突變功能研究
　　目的:對8種甲基丙二酰輔酶A變位酶(methylmalonyl-CoA mutase，MCM)基因(MUT)的變異進行MCM蛋白表達量和酶活性的分析，驗證這8種突變的致病性。
　　方法:(1)選取8例甲基丙二酸血癥患者的8種未報道的MUT基因錯義突變(L140P、A141T、G161V、W309G、、 I505T、Q514K、I597R及G723D)，利用生物信息學軟

2、件預測這些突變對MCM蛋白結構和功能的影響;(2)構建攜帶野生型及這8種突變型MUT cDNA的表達載體并轉染293T細胞;(3)Western blot檢測野生型及突變型MCM蛋白在293T細胞中的表達量;(4) UPLC檢測293T細胞中野生型及突變型MCM酶活性。
　　結果:(1)成功構建了含MUT cDNA的野生型和8種突變型(L140P、A141T、G161V、W309G、、I505T、Q514K、I597R及G723D

3、)表達載體;(2) RealtimePCR結果顯示8種錯義突變型質粒轉染后293T細胞MUT基因mRNA水平與野生型比較無顯著差異(P＞0.05);(3) western blot結果提示5種錯義變異（L140P、 A141T、G161V、W309G及Q514K）較野生型MCM蛋白表達量顯著下降(P＜0.05)，而I505T、1597R及G723D與野生型相比較無差異(P＞0.05);(4) UPLC結果提示8種錯義突變型質粒轉染后29

4、3T細胞的MCM蛋白酶活性(0.31±0.21、1.66±0.01、0.76±0.04、0.19±0.13、1.37±0.24、0.46±0.09、0.86±0.27和1.37±0.13nmol/min/mg protein)均較野生型（3.11±0.13 nmol/min/mg protein）減低（P均＜0.05）;(5)結合患者臨床表型分析，證實這8種MUT基因錯義突變均為致病突變。
　　結論:MUT基因的8種錯義突變(L1

5、40P、A141T、G161V、W309G、、I505T、Q514K、I597R及G723D)均未影響mRNA表達水平，其中5種突變導致MCM蛋白表達量降低，8種突變均導致MCM酶活性下降，均被證實為致病突變。
　　第二部分小鼠腦神經(jīng)元經(jīng)MMA誘導后凋亡變化及LncRNA表達與凋亡信號通路中相關mRNA關系分析
　　目的:通過表達譜芯片對甲基丙二酸(methylmalonic acid，MMA)誘導的原代小鼠皮層神經(jīng)元進行檢

6、測，篩選與神經(jīng)元凋亡相關的差異表達長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，LncRNA）及mRNA，分析LncRNA與凋亡信號通路中相關mRNA的關系，探討MMA腦損傷的部分機制。
　　方法:(1)利用不同濃度的甲基丙二酸誘導小鼠原代皮層神經(jīng)元6h、12h及24h，觀察神經(jīng)元凋亡情況;(2)通過表達譜芯片檢測甲基丙二酸誘導下差異表達的LncRNA及mRNA;(3)對差異表達基因進行基因功能富集(GO)分析及Path

7、way分析，分析與凋亡相關的LncRNA及mRNA;(4)分析LncRNA參與甲基丙二酸誘導的神經(jīng)元凋亡可能途徑。(5)分析LncRNA與凋亡信號通路中相關mRNA的關系.
　　結果:(1)小鼠神經(jīng)元經(jīng)甲基丙二酸誘導后，呈現(xiàn)濃度及時間依賴性凋亡現(xiàn)象;(2)表達譜芯片篩選出與甲基丙二酸作用呈表達遞增趨勢的LncRNA113條，mRNA248條;表達呈遞減趨勢的LncRNA61條，mRNA191條，這些基因主要與轉錄調控及細胞增殖與凋

8、亡等功能相關;(3) Pathway分析結果顯示22條mRNA包含在MAPK信號通路;8條mRNA包含在P53信號通路;(4)包含在MAPK信號通路中的Atf4，、Dusp8、Hspa2等7條mRNA的表達與LncRNA呈顯著相關;(5)6條LncRNA(NONMMUT041857，KnowTID_00005724，NONMMUT001282、 NONMMUT044301、 NONMMUT006249、NONMMUT062897)與At

9、f4表達顯著相關;(6) LncRNA可能通過調控Atf4的表達激活了MAPK信號通路中的一系列凋亡相關基因（p-JNK、c-Jun及p-Akt等）的表達，導致神經(jīng)元的凋亡。
　　結論:(1)本研究進一步證實了MMA腦損傷機制之一為腦神經(jīng)元凋亡;(2)MMA誘導的腦神經(jīng)元凋亡途徑可能通過MAPK及P53信號通路;(3) LncRNA可能通過調控Atf4差異表達，進而調控MAPK信號通路，參與MMA誘導的神經(jīng)元凋亡，為進一步研究MM