新型載萬古霉素類骨磷灰石-聚氨基酸緩釋系統治療慢性骨髓炎的實驗研究.pdf

1、目的：對已經成功制備的新型載PLGA-萬古霉素類骨磷灰石/聚氨基酸緩釋支架分別就其毒副作用、組織相容性、藥物釋放特性、抗菌活性及成骨活性進行體外、體內實驗研究，以期全面、系統評估該材料生物安全性及有效性，為臨床應用提供參考依據。
　　方法：所有實驗均包括體外實驗及體內實驗，分成四部分實施：
　　1、毒性實驗：實驗設載萬古霉素復合人工骨組（VC組）、不載藥復合人工骨組（VUC組）、陰性對照組(NC組)及陽性對照組（PC組）。體

2、外實驗將成功制備的材料浸提液與L929細胞和抗凝兔血共培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、MTT法測細胞相對生長率評估材料對人組織細胞毒性、分光光度法評估其溶血率。體內實驗先建立新西蘭大白兔右側脛骨近端慢性骨髓炎動物模型，按分組行清創(chuàng)并植入各材料，術后觀察動物一般情況、檢測肝腎功、血藥濃度及肝腎組織切片檢查，以評估在體內該新型載萬古霉素材料對動物的毒性及組織相容性。
　　2、藥物釋放實驗：實驗設VC組和PC組（載萬古霉素PMMA材

3、料），體外實驗先制作每間隔48小時的連續(xù)材料浸提液，采用高效液相色譜法測量浸提液中萬古霉素濃度，繪制體外藥物釋放曲線、計算累計釋放百分比。體內實驗先于新西蘭大白兔雙側股骨髁制作直徑5mm、深6mm的圓柱形缺損，按分組植入各材料，術后不同時間測量植入局部萬古霉素濃度，并繪制體內釋放曲線圖。
　　3、抗菌活性實驗：先根據菌種分為標準金葡菌菌組和MRSA菌組，每個菌組里又隨機分為VUC小組、VC小組及PC小組（載萬古霉素PMMA材料），

4、體外實驗將各材料分別置于接種有兩種細菌的培養(yǎng)皿內，培養(yǎng)5天后，測量材料周圍抑菌環(huán)大小，并將材料浸提液與各菌液共培養(yǎng)，根據共培養(yǎng)后菌夜?jié)岫扔嬎阋志剩容^各組抗菌作用。體內實驗同前制作脛骨近端慢性骨髓炎動物模型，先分成標準金葡菌組和MRSA組，每組又隨機分成四個小組：A小組：VC組；B小組：V-PMMA組；C小組：VUC組；D小組：BC組，按分組行清創(chuàng)植入各材料，術后觀察模型一般情況，行病灶X片評分，監(jiān)測血白細胞及病灶細菌濃度，并行大體及

5、組織學評估。
　　4、成骨活性實驗：體外實驗分為VUC組、VC組及空白組（BC），將各材料與成骨樣細胞MG63共培養(yǎng)，以倒置相差顯微鏡及電鏡觀察細胞生長及與材料粘附情況，MTT比色法檢測細胞增殖并繪制其生長曲線。檢測細胞內ALP及鈣含量評估成骨活性。體內實驗先制作慢性骨髓炎的動物模型，分成標準金葡菌組和MRSA組，每組又隨機分成四個小組：A小組：VC組；B小組：V-PMMA組；C小組：VUC組；D小組：BC組，按分組行清創(chuàng)植入各材

6、料，術后通過大體標本、X片、組織切片染色、鈣黃綠素熒光標記評估體內成骨情況。
　　結果：
　　5、毒性實驗：在體外各個時間點VC組及VUC組的毒性分級均為1級以下，鏡下細胞形態(tài)與 NC組無明顯差別，兩組兔血的溶血率分別為2.27％及1.42%，遠遠小于ISO規(guī)定（<5%）。在體內與NC組比較，各監(jiān)測指標無明顯差異，體內各代謝時相點萬古霉素血藥濃度遠遠低于其中毒水平(60mg/L)。
　　6、藥物釋放實驗：VC組體外萬古

7、霉素釋放表現出明顯三相釋放特點，前48小時表現出高濃度突釋，第20天出現第二個釋放高峰，之后釋放逐漸下降。累積釋放量在第一個48小時為43.02%，38天時達到89.22%。在體內兩種材料的萬古霉素釋放曲線均表現為雙相，釋藥峰值均大約在第14天，之后累積濃度進行性下降。VC組體內釋放藥物濃度保持在MIC90以上近42天，而PC組不到28天。
　　7、抗菌活性實驗：在體外無論是對標準金葡菌還是MRSA菌VC組和PC組均可見明顯抑菌環(huán)

8、形成，但VC組直徑較PC組大，抑菌時間持續(xù)超過28天。PC組抑菌作用僅持續(xù)14天。VUC組在整個實驗過程中無抑菌環(huán)形成，抑菌率低于20%。標準金葡菌與MRSA菌間無差別。體內無論是標準菌組還是MRSA菌組的A、B小組，術后模型均無病理性骨折、體重恢復、無竇道形成，白細胞計數下降。與術前比較，Norden評分明顯改善、肉眼觀及鏡下觀炎性反應明顯好轉，與術前及另兩組比較，單位重量骨標本菌落數明顯減少。
　　8、成骨活性實驗：在體外將兩

9、種材料與 MG63細胞共培養(yǎng)后，與BC組比較，細胞生長及增殖均無明顯差別，與材料粘附好。各時間點細胞內ALP活性及鈣含量均與BC組無差別。在體內，無論是標準菌組還是MRSA菌組的A小組術后材料與骨結合緊密，骨長入明顯，骨缺損愈合，余小組材料與骨無明顯結合，骨缺損均未愈合，周圍骨骨質疏松明顯。組織切片見A小組材料周圍膠原纖維包裹，血管及編織骨形成，B小組骨水泥周圍未見膠原纖維及新骨形成，C小組可見少量膠原纖維及新骨形成。
　　結論：

10、
　　1、載本實驗劑量的萬古霉素BHA/PAA復合生物材料對L929細胞無毒性，具有良好的生物相容性。體內萬古霉素血藥濃度遠遠低于其中毒水平，無明顯全身中毒反應，不影響動物肝腎功能。完全符合ISO關于生物材料安全性規(guī)定
　　2、V-BHA/PAA材料加工制作過程對所載萬古霉素無明顯破壞。其體外萬古霉素釋放呈三相釋放模式，具有兩個釋放高峰，持續(xù)釋放時間可達到38天，最終藥物累積釋放達89.22%。體內萬古霉素釋放呈雙相，局部藥

11、物濃度高峰約在第14天，MIC90以上濃度持續(xù)將近42天
　　3、無論是體外、體內V-BHA/PAA支架對標準金葡菌及 MRSA菌均表現出一致的殺菌作用，明顯強于V-PMMA支架，其體外抑菌時間超過28天。在體內其對慢性骨髓炎治愈率分別達到：75%（標準菌）和66.67%（MRSA菌），明顯高于V-PMMA(50%和41.67%)
　　4、在體外，載與不載萬古霉素BHA/PAA材料均不影響MG63細胞生長、增殖，細胞與材料粘