STAT3及其相關(guān)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA在肝內(nèi)膽管癌中的表達(dá)與調(diào)控機(jī)制的初步研究.pdf

1、本文從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 STAT3及其相關(guān)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA在肝內(nèi)膽管癌中的表達(dá)與調(diào)控機(jī)制的初步研究
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)的目的在于通過(guò)研究轉(zhuǎn)錄信號(hào)傳導(dǎo)因子及激活子3(Signal Transducer and Activator of Transcription3，STAT3)在肝內(nèi)膽管癌中的表達(dá)情況，明確腫瘤原發(fā)灶、近腫瘤肝組織以及淋巴結(jié)中STAT3表達(dá)及其差異，并從數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選STAT3相關(guān)的競(jìng)

2、爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(Competing endogenous RNAs，ceRNA)，明確ceRNA與STAT3的表達(dá)相關(guān)性，并進(jìn)一步驗(yàn)證候選ceRNA在STAT3調(diào)控肝內(nèi)膽管癌過(guò)程中的作用。
　　肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(ICC)的發(fā)病率約占肝臟原發(fā)性腫瘤的10％至15％，是發(fā)病率僅次于肝細(xì)胞癌的肝臟原發(fā)惡性腫瘤。肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌起源于肝臟的二級(jí)膽管及其分支上皮，其病理學(xué)種類多數(shù)為不同分化程度的腺癌，癌細(xì)胞浸潤(rùn)性侵襲匯管區(qū)血管或神經(jīng)。因其浸潤(rùn)性

3、生長(zhǎng)的特點(diǎn)，ICC形成肝內(nèi)轉(zhuǎn)移或侵襲肝外淋巴結(jié)甚至臨近器官的幾率大于其他肝臟原發(fā)的惡性腫瘤。在實(shí)際的臨床診療過(guò)程中，ICC與其他的肝臟原發(fā)的惡性腫瘤相比切除率、治愈率更低，并且缺乏有效的輔助治療方法。截止到目前為止手術(shù)切除仍是治愈肝內(nèi)膽管癌唯一有效的途徑，但因肝內(nèi)膽管癌初期癥狀不明顯且病程發(fā)展較快，確診時(shí)有機(jī)會(huì)接受根治性手術(shù)治療的患者并不占多數(shù)。
　　STAT3是一類在各種組織與細(xì)胞中廣泛表達(dá)的癌基因，STAT3通過(guò)磷酸化的方式被

4、激酶活化，經(jīng)過(guò)活化后STAT3通過(guò)細(xì)胞因子以及生長(zhǎng)因子將其信號(hào)向細(xì)胞核內(nèi)傳遞，從而達(dá)到影響靶基因轉(zhuǎn)錄的效果。如促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞生成、促進(jìn)或抑制微血管生成、細(xì)胞粘附等， STAT3是JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的組成部分。
　　競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNAs)假說(shuō):不同種類的RNA之間可以通過(guò)位于RNA上的microRNA的結(jié)合位點(diǎn)(MREs)競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合，這種彼此之間的競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合實(shí)現(xiàn)了ceRNAs之間調(diào)控表達(dá)的互相影響，因而形

5、成了一種龐大的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　STAT3的表達(dá)在近期的多項(xiàng)研究中被證實(shí)密切影響著腫瘤的預(yù)后，急性髓細(xì)胞性白血病、皮膚癌、非小細(xì)胞型肺癌等腫瘤的無(wú)瘤生存期、5年生存率以及中位生存時(shí)間被證實(shí)與STAT3的表達(dá)相關(guān)。而針對(duì)上述腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究表明，microRNA可直接或間接的參與STAT3在腫瘤中的活化調(diào)控。根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA假說(shuō)，ceRNA可通過(guò)共同的microRNA結(jié)合位點(diǎn)對(duì)其競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合，這就提示我們micr

6、oRNA可作為中介將ceRNA與STAT3聯(lián)系在一起。查閱文獻(xiàn)后，我們發(fā)現(xiàn)尚未有研究明確ceRNA在肝內(nèi)膽管癌中調(diào)控STAT3的表達(dá)，這為我們的研究奠定了理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　病理評(píng)分區(qū)分表達(dá)情況:
　　對(duì)納入本實(shí)驗(yàn)的組織標(biāo)本（腫瘤組織、近腫瘤肝組織、淋巴結(jié)組織）進(jìn)行免疫組化染色，并根據(jù)免疫組化顯色的結(jié)果進(jìn)行評(píng)分（陽(yáng)性細(xì)胞著色程度，陽(yáng)性細(xì)胞占所觀察同類細(xì)胞數(shù)的百分比），區(qū)分STAT3在腫瘤組織中的高表達(dá)與低表達(dá)。

7、
　　功能學(xué)實(shí)驗(yàn):
　　本研究構(gòu)建了以pcDNA3.1(-)為載體的STAT3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，并將pcDNA3.1-STAT3以及pcDNA3.1空載體導(dǎo)入膽管癌9810細(xì)胞系中。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)，探究STAT3過(guò)表達(dá)對(duì)9810細(xì)胞遷移能力的影響。
　　機(jī)制實(shí)驗(yàn):
　　查詢ceRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選STAT3可能的候選ceRNAs(ACSL4、IFNAR2、MAP3K5、MAP3K9、SOD2、TNF

8、RSF10B、XIAP、LncRNA-NEAT1)，RT-PCR檢測(cè)8種候選ceRNAs與STAT3表達(dá)之間的關(guān)系。應(yīng)用小分子siRNA干擾候選ceRNA，Real-Time PCR和Western-blot檢測(cè)STAT3的表達(dá)情況，初步明確ceRNA對(duì)STAT3表達(dá)調(diào)控作用。
　　結(jié)果:
　　免疫組化結(jié)果顯示，在48例肝內(nèi)膽管癌患者腫瘤組織內(nèi)STAT3陽(yáng)性表達(dá)率為85.4％(48例標(biāo)本中有41例呈陽(yáng)性表達(dá));而48例近腫瘤

9、肝組織標(biāo)本中STAT3的陽(yáng)性表達(dá)率為12.5％。納入本實(shí)驗(yàn)的病例中有16例患者發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，我們檢測(cè)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)與原發(fā)腫瘤灶中STAT3的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其中13例淋巴結(jié)STAT3表達(dá)水平比原發(fā)腫瘤中高，占淋巴轉(zhuǎn)移患者總體的81.5％。膽管癌細(xì)胞系中導(dǎo)入STAT3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-STAT3，劃痕實(shí)驗(yàn)以及transwell實(shí)驗(yàn)表明導(dǎo)入STAT3過(guò)表達(dá)的9810細(xì)胞遷移能力高于導(dǎo)入空載體的9810細(xì)胞。PCR結(jié)果提示我們:8種候選ce

10、RNA表達(dá)水平與STAT3表達(dá)水平呈正相關(guān)，其中LncRNA-NEAT1的表達(dá)與STAT3呈顯著相關(guān)(P＜0.001)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)提示并經(jīng)文獻(xiàn)查閱后我們以LncRNA-NEAT1作為主要研究對(duì)象，分別采用干擾LncRNA-NEAT1的siNEAT1以及對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染RBE細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組相較于對(duì)照組LncRNA-NEAT1以及STAT3的RNA表達(dá)水平均下調(diào)。Western-blot結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組相較于對(duì)照組STAT3表達(dá)降低。<

11、br>　　結(jié)論:
　　STAT3在肝內(nèi)膽管癌腫瘤組織中表達(dá)高于近腫瘤肝組織;STAT3能夠促進(jìn)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力;候選ceRNAs（LncRNA-NEAT1）與腫瘤組織中STAT3的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(P＜0.001);LncRNA-NEAT1作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA可以調(diào)節(jié)STAT3的表達(dá)。
　　第二部分 循環(huán)腫瘤細(xì)胞在原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者外周血中分離捕獲技術(shù)及其應(yīng)用
　　目的:
　　本研究利用循環(huán)腫瘤細(xì)

12、胞直徑大于正常細(xì)胞的特征，采用特定孔徑薄膜濾過(guò)富集的方法分離肝細(xì)胞癌患者外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。排除正常細(xì)胞干擾后對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢查數(shù)據(jù)、臨床資料、病理結(jié)果等分析循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)與肝細(xì)胞癌腫瘤形成之間的關(guān)系。應(yīng)用顯微切割分離已捕獲的單個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，并通過(guò)單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增循環(huán)腫瘤細(xì)胞基因組，為肝細(xì)胞癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞高通量測(cè)序做前期的準(zhǔn)備工作。
　　循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CircuLating tumor ce

13、ll，CTC）概念的首次提出距今已有一百四十余年的歷史，CTC是指進(jìn)入外周血中的惡性腫瘤細(xì)胞。最近十年來(lái)因?yàn)楦患⒎蛛x、鑒別手段的豐富，CTC才得到較為系統(tǒng)的研究。文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)， CTC在腫瘤的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)中扮演著重要的角色。應(yīng)用CTC作為標(biāo)志物檢測(cè)早期患者以及監(jiān)測(cè)化療藥物的耐藥性已經(jīng)在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌的臨床診療中得到部分應(yīng)用。循環(huán)腫瘤細(xì)胞微栓子（Circulating tumor microemboli，CTM）是由三個(gè)或

14、三個(gè)以上CTC聚集而成的癌細(xì)胞栓子，CTM的出現(xiàn)已被近期研究證實(shí)與胰腺癌、前列腺癌等腫瘤晚期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)病人群常見于HBV感染史、飲酒史的中年男性或絕經(jīng)期后女性，因其生長(zhǎng)速度快、早期無(wú)明顯癥狀導(dǎo)致手術(shù)根治性切除率低預(yù)后差。據(jù)統(tǒng)計(jì)2012年我國(guó)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)病率占全球發(fā)病率的52.7％為世界第一，我國(guó)東部沿海地區(qū)HCC發(fā)病率高于西部?jī)?nèi)陸省份，男性發(fā)病率顯著高于女性（平均4.15∶1）。在全

15、球范圍內(nèi)雖然通過(guò)推廣新生兒乙肝疫苗的注射以及針對(duì)乙肝病毒攜帶者腹部超聲檢查降低了HCC的發(fā)生率并且提高了腫瘤的早期檢出率，但因各種客觀條件制約以及HCC本身的生物學(xué)特性導(dǎo)致其病死率依然居高不下。
　　CTC因其本身在腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中扮演的重要角色，被應(yīng)用在監(jiān)測(cè)HCC轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的機(jī)制研究上。而CTC所攜帶的基因組與腫瘤組織基因組的同源性，可被應(yīng)用于化療藥物耐藥性的監(jiān)測(cè)。我們的研究嘗試從肝癌患者外周血中分離捕獲CTC并擴(kuò)增其攜帶的基因

16、組，從而達(dá)到體液活檢的目的。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)對(duì)象為經(jīng)東方肝膽外科醫(yī)院確診的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者，在取得知情同意后，取患者外周血6ml。應(yīng)用友芝友公司生產(chǎn)YZY-CTC-BIOPSY異常細(xì)胞分離染色儀截留細(xì)胞，通過(guò)腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)與正常細(xì)胞的區(qū)別鑒別CTC，并應(yīng)用免疫熒光染色的方法對(duì)CTC進(jìn)一步確認(rèn)（有效排除正常細(xì)胞干擾）。對(duì)確認(rèn)后的CTC進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)患者術(shù)后病理學(xué)資料、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、臨床檢測(cè)指標(biāo)，分析計(jì)數(shù)與疾病及其病理

17、數(shù)據(jù)之間的關(guān)系。顯微激光切割的方法將CTC分離，利用單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增CTC基因組，用于高通量測(cè)序或腫瘤病人耐藥性檢測(cè)等個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療的開展。
　　結(jié)果與結(jié)論:
　　本研究應(yīng)用CTC-BIOPSY異常細(xì)胞分離染色儀可以有效的將循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)以及循環(huán)腫瘤細(xì)胞微栓子(CTM)截留在篩孔濾膜上;免疫熒光染色鑒別可以有效的排除WBC對(duì)CTC計(jì)數(shù)的影響:顯微激光切割平臺(tái)可以捕獲薄膜截留的CTC細(xì)胞，并在收集時(shí)將CTC與正