常用實(shí)驗(yàn)動物與人腸道、口腔、生殖道微生物組比較.pdf

1、目的：采用基于細(xì)菌16S rRNA高通量測序法，研究幾種常用實(shí)驗(yàn)動物（西藏小型豬、比格犬、獼猴、新西蘭大白兔、Wistar大鼠）的菌群結(jié)構(gòu)以及它們各自的特點(diǎn)和差異性，并和正常人的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析，初步討論常用實(shí)驗(yàn)動物與人有關(guān)菌群的差異和相似性，以此為人體微生態(tài)方面的醫(yī)學(xué)研究提供基礎(chǔ)性資料，并為在選擇研究微生態(tài)使用的實(shí)驗(yàn)動物模型時提供一些參考。
　　方法：第一章 腸道菌群樣品采集及數(shù)據(jù)分析
　　采集東莞松山湖明珠實(shí)驗(yàn)動物科技有

2、限公司西藏小型豬、南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心比格犬、獼猴、新西蘭大白兔、Wistar大鼠新鮮糞便，收集于EP管中，每個品種4只（成年），雄性1只，雌性3只;共20個樣品，-20℃保存。
　　經(jīng)糞便樣品基因組DNA提取后，用細(xì)菌16S rRNA通用引物，PCR擴(kuò)增樣品的16S rRNA V4區(qū)。將PCR終產(chǎn)物經(jīng)過Illumina Hiseq2000平臺進(jìn)行PE100-bp測序后，得到高通量下的原始數(shù)據(jù)序列，高通量測序數(shù)據(jù)用BIPES(

3、Barcoded Illumina Paired-end(PE) Sequencing)流程進(jìn)行初步原始序列處理，采用分階段聚類算法Two-Stage-Clustering(TSC)將干凈序列聚類成操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTUs)， OTU聚類過程中主要采用三種距離法:最遠(yuǎn)距離法、最近距離法、平均距離法。對于獲得的OTUs，使用GAST(GlobalAlignment for Sequen

4、ce Taxonomic)算法對其進(jìn)行分類。
　　第二章 口腔菌群樣本采集及數(shù)據(jù)分析
　　用一次性棉拭子采集東莞松山湖明珠實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司西藏小型豬、南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心比格犬、獼猴、新西蘭大白兔、Wistar大鼠新鮮口腔菌群樣品，每個品種4只（成年），雄性1只，雌性3只;共20個樣品，-20℃保存。
　　第三章 生殖道樣本采集及數(shù)據(jù)分析
　　用一次性棉拭子采集東莞松山湖明珠實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司西藏小型豬

5、、南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心比格犬、獼猴生殖道菌群樣品，每個品種3只（成年），-20℃保存。人的生殖道菌群數(shù)據(jù)由南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院提供。經(jīng)過細(xì)菌總DNA提取后，用細(xì)菌16S rRNA通用引物，PCR擴(kuò)增樣品的16S rRNA V4區(qū)。將PCR終產(chǎn)物經(jīng)過Illumina Hiseq2000平臺進(jìn)行PE100-bp測序后，得到高通量下的原始數(shù)據(jù)序列，數(shù)據(jù)的處理方法與第一章相同。
　　結(jié)果：第一章 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

6、　　1、α多樣性分析中，PD_whole_tree指數(shù)，人與西藏小型豬、獼猴的差異顯著(P＜0.05)，西藏小型豬與獼猴、比格犬、新西蘭大白兔、Wistar大鼠差異顯著(P＜0.05)，其余物種間均無顯著差異(P＞0.05);Shannon指數(shù)，人和西藏小型豬差異顯著(P＜0.05)，西藏小型豬與比格犬、新西蘭大白兔差異顯著(P＜0.05)，其余物種間均無顯著差異(P＞0.05)。
　　2、β多樣性分析表明，比格犬的未加權(quán)UniF

7、rac距離和人最接近，西藏小型豬的加權(quán)UniFrac距離和人的距離最近，菌群相似度最高。
　　3、菌群結(jié)構(gòu)門水平中，西藏小型豬與人的腸道菌群門結(jié)構(gòu)水平最為相近。菌群結(jié)構(gòu)屬水平中，人的腸道菌群中擬桿菌屬（Bacteroides）的比例最高，其次為普氏菌屬（Prevotella）、棲糞桿菌屬（Faecalibacterium）、羅斯氏菌屬（Roseburia）及梭桿菌屬（Fusobacterium），占人腸道菌群的60％以上。豬、猴、

8、鼠的腸道菌群中普氏菌屬（Prevotella）均占有較大比例，但是豬的腸道菌群主要以普氏菌屬（Prevotella）、梭桿菌屬（Fusobacterium）及密螺旋體屬（Treponema）為主;猴的腸道菌群以乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、顫桿菌克屬（Oscillibacter）為主;鼠的腸道菌群以普氏菌屬（Prevotella）、貪噬菌屬（Variovorax）為主。犬的腸道菌群以鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、

9、梭桿菌屬（Fusobacterium）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為主。兔的腸道菌群以擬桿菌屬（Bacteroides）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為主。
　　第二章 口腔菌群結(jié)構(gòu)分析
　　1、西藏小型豬、比格犬、獼猴、新西蘭大白兔、Wistar大鼠樣品20個及人口腔樣品15個，質(zhì)控后獲取了939272條干凈的16S rRNA基因序列，獲得的最低基因序列為1

10、01條，35個樣品全部納入后續(xù)分析。
　　2、α多樣性分析表明，人、西藏小型豬、比格犬、獼猴、新西蘭大白兔、Wistar大鼠口腔菌群Shannon指數(shù)均無顯著差異(P＞0.05)。人與豬、犬、猴、兔、大鼠差異顯著(P＜0.05)，豬與犬、猴、兔差異顯著(P＜0.05)，其他均無顯著差異(P＞0.05)。
　　3、β多樣性分析表明，未加權(quán)UniFrac距離比較中，西藏小型豬、比格犬、獼猴、新西蘭大白兔、Wistar大鼠的口腔菌

11、群的豐富度比較相近，這可能是由于實(shí)驗(yàn)動物特定的生活環(huán)境造成的;相對而言，猴和豬與人的距離較為接近，表明猴和豬與人的口腔菌群菌落的相似度高于其他物種。加權(quán)UniFrac距離中，考慮到豐度的關(guān)系，猴和人距離較近，相似度較高。
　　4、人的口腔菌群門結(jié)構(gòu)水平中有五個門的細(xì)菌占主要地位，分別是:放線菌門（Actinobacteria），厚壁菌門（Firmicutes），變形菌門（Proteobacteria），擬桿菌門（Bacteroid

12、etes）和梭桿菌門(Fusobacteria)。豬、犬、猴、兔、大鼠口腔菌群門結(jié)構(gòu)水平均以變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）為主，占50％以上，豬、猴、大鼠的門結(jié)構(gòu)水平較為相似，都有放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）。相比較而言，豬的口腔菌群門水平更接近人。不同物種口腔菌群在屬水平上存在差異較大，五個物種都有奈瑟氏菌

13、屬（Neisseria）、羅氏菌屬（Roseburia）、卟啉菌屬（Porphyromonas）、莫拉氏菌屬（Moraxella），口腔鏈球菌屬(Streptococcus)、放線茵屬（Actinobacillus）、梭桿菌屬（Fusobacterium）、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)。
　　第三章 生殖道菌群結(jié)構(gòu)分析
　　1、西藏小型豬、比格犬、獼猴樣品9個與30～50歲健康人群的樣品10個，共19個樣品質(zhì)控后

14、獲取了135191條干凈的16S rRNA基因序列，獲得的最低基因序列為1935條，19個樣品全部納入后續(xù)分析。
　　2、α多樣性分析表明，各物種間均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明豬、犬、猴和人的生殖道菌群無顯著差異(P＞0.05)。
　　3、β多樣性分析亦表明，豬、犬、猴和人的生殖道菌群無顯著差異（P＞0.05）。
　　4、人、豬、犬、猴生殖道菌群門水平均以厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）

15、、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門(Actinobacteria)為主。其中西藏小型豬與人的生殖道菌群門結(jié)構(gòu)水平較為相近，厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）占所有菌群門水平的90％以上，犬和猴的門結(jié)構(gòu)水平較為相似，梭桿菌門(Fusobacteria)占10-20％以上。四個物種的屬水平分布大不相同。

16、但總的看來人的生殖道菌群中含有的普雷沃菌屬(Prevotella)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬（Streptococcus）、厭氧球菌屬（Anaerococcus）、梭桿菌屬（Fusobacterium）在豬、犬、猴的生殖道菌群中都有出現(xiàn)。
　　結(jié)論:1、西藏小型豬、比格犬、獼猴、新西蘭大白兔、Wistar大鼠與人的腸道菌群在屬水平上存在較大差異，西藏小型豬和獼猴可能是適合做飲食結(jié)構(gòu)相關(guān)的研究的模型動物，獼

17、猴可能是適合做關(guān)節(jié)炎及與肥胖疾病相關(guān)的模型動物，比格犬可能是適合做與慢性消化系統(tǒng)疾病相關(guān)的模型動物。
　　2、西藏小型豬、比格犬、獼猴、新西蘭大白兔、Wistar大鼠與人的口腔菌群結(jié)構(gòu)各不相同，在菌群的豐富度和相似程度上，猴最接近人。猴可能是研究與梭桿菌門相關(guān)口腔疾病較適宜的動物模型，豬可能是與變形菌門相關(guān)口腔感染性疾病較為合適的模型動物，犬可能是研究與螺旋體門相關(guān)的慢性牙周病較為合適的模型動物。
　　3、西藏小型豬、比格犬