花椒麻素對(duì)試驗(yàn)大鼠蛋白質(zhì)合成與分解代謝影響的機(jī)制研究.pdf

1、花椒（Z.bungeanum maxim）是我國(guó)及世界上部分國(guó)家重要的、較為廣泛食用的天然香辛料和中藥配料，其有效成分為花椒呈香和呈味成分。其中，花椒的呈味成分為花椒麻味物質(zhì)，也稱為花椒麻素，是一類存在于花椒中結(jié)構(gòu)獨(dú)特的重要活性成分（酰胺類物質(zhì)），具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎止痛以及抗血小板凝集等多種生理活性。近年來(lái)的研究表明，花椒麻素可促進(jìn)體內(nèi)脂肪的氧化，減少脂肪沉積和血清中甘油三酯濃度的作用；另外，花椒麻素還可通過(guò)抑制糖異生作用，減少肝

2、糖的輸出，并能修復(fù)胰島功能，促進(jìn)胰島素的分泌來(lái)改善鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ)誘異的糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂。雖然花椒麻素對(duì)人體的功能作用已有一定的研究，但仍存在較多不明確的問(wèn)題，尤其是對(duì)體內(nèi)蛋白質(zhì)合成與分解代謝方面的作用等方面研究甚少。現(xiàn)有研究表明，蛋白質(zhì)合成代謝及分解代謝作用都依賴于mTOR途徑，這意味著mTOR可能作為蛋白質(zhì)合成與分解過(guò)程的交叉位點(diǎn)，通過(guò)對(duì)下游分子的表達(dá)調(diào)控，起到調(diào)控蛋白質(zhì)代謝的作用。而mTOR的

3、活化受上游多個(gè)信號(hào)通路(受營(yíng)養(yǎng)因子、生長(zhǎng)因子、能量)所介導(dǎo)，其中腺苷酸活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)可負(fù)向調(diào)控 mTOR。泛素蛋白酶體途徑(Ubiquitin–proteasome pathway，UPP)通過(guò)三酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)將泛素連接于靶蛋白使其泛素化，介導(dǎo)了真核生物80%-85%的蛋白降解。然而花椒麻素對(duì)機(jī)體蛋白質(zhì)合成和分解代謝的影響如何？以何種刺激信號(hào)(營(yíng)養(yǎng)因子、生長(zhǎng)因子、能量等

4、)去影響？等均不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用大鼠動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)，采用qPCR和western-blot等技術(shù)從核酸水平和蛋白水平探明花椒麻素對(duì)不同體質(zhì)（健康、糖尿病-Ⅰ型）大鼠個(gè)體的機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)合成代謝的mTOR途徑、AMPK途徑和分解代謝的UPP途徑的影響，最終明確花椒麻素對(duì)機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)合成與分解代謝的影響及機(jī)制，并建立起一套研究生物活性物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)代謝影響分子機(jī)制的技術(shù)與方法體系。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、呕ń仿樗貙?duì)健康SD試驗(yàn)大鼠

5、機(jī)體蛋白質(zhì)代謝的影響研究。將32只健康 SD雄性大鼠按體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組(Control)，花椒麻素的大豆油溶液高劑量灌胃試驗(yàn)組8mg/(kg.d)(HDG)、中劑量灌胃試驗(yàn)組4mg/(kg.d)(MDG)和低劑量灌胃試驗(yàn)組2mg/(kg.d)(LDG)，每組各8只，試驗(yàn)期為28天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)定試驗(yàn)大鼠血清、肝臟、骨骼肌和空腸等組織中與機(jī)體蛋白質(zhì)代謝直接相關(guān)的生理生化指標(biāo)、代謝酶的活性和激素的水平等的變化；qPCR檢測(cè)其骨骼肌中

6、肌細(xì)胞生成素(myogenin, MyOG)、肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin, MSTN)、鈣蛋白酶-1(μ-calpain, CAPN-1)、鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin, CAST)的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，以探討花椒麻素對(duì)健康SD試驗(yàn)大鼠機(jī)體蛋白質(zhì)代謝的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，花椒麻素可顯著(P＜0.05)提高大鼠相對(duì)骨骼肌的重量，可顯著(P＜0.05)降低腹脂率，但對(duì)其它臟器的相對(duì)重量影響不顯著(P＞0

7、.05)；顯著(P＜0.05)增加試驗(yàn)大鼠血清中總蛋白、白蛋白和球蛋白的含量，但對(duì)白蛋白/球蛋白比值的影響不顯著(P＞0.05)；顯著(P＜0.05)降低試驗(yàn)大鼠血尿氮(BUN)的含量，但對(duì)大鼠血清Cr含量的影響不顯著(P＞0.05)；顯著(P＜0.05)升高血清中三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine, T3)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin like growth factor-1, IGF-I)的含量，但對(duì)血清中甲

8、狀腺素(thyroxine, T4)，白細(xì)胞介素6(interleukin, IL-6)和胰島素（insulin, Ins)的影響不顯著(P＞0.05)；中、高劑量試驗(yàn)組的花椒麻素可顯著(P＜0.05)提高大鼠空腸刷狀緣γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-glutamyltransferase,γ-GT)活性和空腸氨肽酶 N(aminopeptidase N, APN)活性(P＜0.05)，但對(duì)空腸羧肽酶 A(Carboxypeptidase, CP

9、A)和二肽基肽酶-Ⅳ(dipeptidyl peptidase-Ⅳ, DPP-Ⅳ)活性的影響不顯著(P＞0.05)；顯著(P＜0.05)升高試驗(yàn)大鼠骨骼肌中RNA的含量(P＜0.05)，而對(duì)大鼠骨骼肌中DNA含量無(wú)顯著影響(P＞0.05)，高劑量試驗(yàn)組和中劑量試驗(yàn)組顯著(P＜0.05)提高骨骼肌中RNA/DNA比值。此外，花椒麻素可顯著(P＜0.05)上調(diào)大鼠骨骼肌中IGF-Ⅰ、MyOG、CAPN-1和CAST mRNA表達(dá)量，顯著(P

10、＜0.05)下調(diào)MSTN mRNA表達(dá)量。結(jié)果提示：灌胃適當(dāng)劑量的花椒麻素可顯著增加試驗(yàn)大鼠的相對(duì)骨骼肌重，減少腹脂的沉積；顯著降低體重；說(shuō)明花椒麻可通過(guò)調(diào)節(jié)能量分配來(lái)改變?cè)囼?yàn)大鼠胴體的組成。適當(dāng)劑量的花椒麻素可顯著提高試驗(yàn)大鼠血清總蛋白的含量，顯著增強(qiáng)肝臟中GPT的活性，促進(jìn)機(jī)體蛋質(zhì)的合成代謝。另外，花椒麻素可通過(guò)上調(diào)MyOG mRNA表達(dá)量的同時(shí)下調(diào)抑制基因MSTN mRNA表達(dá)量，促進(jìn)骨骼肌的生長(zhǎng)；可由CAPN-1/CAST系統(tǒng)增

11、強(qiáng)骨骼肌蛋白質(zhì)的更新，并促進(jìn)蛋白質(zhì)的沉積。其中，高劑量試驗(yàn)組和中劑量試驗(yàn)組促進(jìn)機(jī)體蛋白質(zhì)沉積的效果比低劑量試驗(yàn)組顯著(P＜0.05)。
　?、苹ń仿樗貙?duì)健康SD試驗(yàn)大鼠氨基酸及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體影響的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)定試驗(yàn)大鼠血清、肝臟、骨骼肌及空腸中15種氨基酸的含量；應(yīng)用 qPCR檢測(cè)空腸、骨骼肌、肝臟中相應(yīng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，以探討氨基酸及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體是否為花椒麻素對(duì)健康 SD試驗(yàn)大鼠蛋白質(zhì)沉積的信號(hào)因子。

12、結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，花椒麻素可顯著(P＜0.05)升高試驗(yàn)大鼠血清和骨骼肌中Asp、Glu、Asn、Arg、Ser和Ala含量；顯著(P＜0.05)降低試驗(yàn)大鼠血清中Gln含量；顯著(P＜0.05)增加骨骼肌和空腸組織中Gln含量；肝臟中Gln含量有增加趨勢(shì)，但不顯著(P＞0.05)。花椒麻素對(duì)試驗(yàn)大鼠骨骼肌中BCAA的影響主要表現(xiàn)為降低其含量，其中高劑量試驗(yàn)組和中劑量試驗(yàn)組可顯著(P＜0.05)降低骨骼肌Ile的含量(P＜0.

13、05)?；ń仿樗乜娠@著(P＜0.05)上調(diào)試驗(yàn)大鼠空腸PepT1、ECAA1、ASCT1和PAT1 mRNA表達(dá)量；顯著(P＜0.05)下調(diào)試驗(yàn)大鼠空腸CAT-1、y+LAT1、b0,+AT mRNA表達(dá)量，但對(duì)ATB0,+的影響不顯著(P＞0.05)。顯著(P＜0.05)上調(diào)試驗(yàn)大鼠肝臟PepT1、ASCT1和ECAA1 mRNA表達(dá)量；顯著(P＜0.05)上調(diào)骨骼肌PAT1 mRNA表達(dá)量，顯著(P＜0.05)下調(diào)ATF4、CD98

14、和y+LAT1 mRNA表達(dá)量。結(jié)果提示：花椒麻素升高試驗(yàn)大鼠血清和骨骼肌中的生糖氨基酸，其主要來(lái)源于機(jī)體內(nèi)相應(yīng)α-酮酸自身合成導(dǎo)致。其中，高劑量試驗(yàn)組和中劑量試驗(yàn)組升高試驗(yàn)大鼠血清和骨骼肌中生糖氨基酸效果顯著高于低劑量試驗(yàn)組(P＜0.05)。綜合以上結(jié)果可知，氨基酸和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體并非花椒麻素影響試驗(yàn)大鼠蛋白質(zhì)沉積的信號(hào)因子。
　?、腔ń仿樗貙?duì)健康SD試驗(yàn)大鼠蛋白質(zhì)合成與分解代謝影響的機(jī)制研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用實(shí)時(shí)熒光定量及其蛋

15、白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)試驗(yàn)大鼠肝臟及骨骼肌中與蛋白質(zhì)合成與分解代謝的相關(guān)基因mRNA及其蛋白表達(dá)量，以進(jìn)一步探討花椒麻素對(duì)健康SD試驗(yàn)大鼠蛋白質(zhì)合成與分解代謝影響的機(jī)制。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，花椒麻素可顯著(P＜0.05)上調(diào)試驗(yàn)大鼠肝臟中IGF-I、mTOR、PI3K和PKB mRNA表達(dá)量，顯著(P＜0.05)上調(diào)試驗(yàn)大鼠肝臟的mTOR, p-mTOR(Ser2448)、PI3K(p110)、PKB和p-PKB(Ser437)蛋白

16、水平；顯著(P＜0.05)上調(diào)試驗(yàn)大鼠骨骼肌IGF-I、mTOR、PI3K、PKB、TSC2 mRNA的表達(dá)量，顯著(P＜0.05)上調(diào)試驗(yàn)大鼠骨骼肌mTOR, p-mTOR(Ser2448)、PI3K(p110)、PKB、p-PKB(Ser437)和TSC2蛋白水平，而對(duì)AMPK、p-AMPK(Thr172)和TSC1蛋白水平影響不顯著（P＞0.05）。另外，灌胃花椒麻素可顯著(P＜0.05)下調(diào)試驗(yàn)大鼠骨骼肌atrogin-1/MA

17、Fbx、MuRF1、FoxO1、FoxO3和FoxO4 mRNA的表達(dá)量和蛋白水平。結(jié)果提示：花椒麻素對(duì)健康SD試驗(yàn)大鼠骨骼肌中AMPK途徑的影響不顯著(P＞0.05)；可通過(guò)IGF-I→PI3K→PKB→mTOR途徑增加機(jī)體蛋白質(zhì)合成，并通過(guò)UPP途徑減少蛋白質(zhì)的分解。
　?、然ń仿樗貙?duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病試驗(yàn)大鼠蛋白質(zhì)代謝的影響和機(jī)制研究。以40只雄性糖尿病試驗(yàn)大鼠為研究對(duì)象，并隨機(jī)分為空白對(duì)照組(Control)，模型對(duì)照組（

18、DM），高劑量灌胃8mg/(kg.d)(DM-HD)試驗(yàn)組、中劑量灌胃4mg/(kg.d)(DM-MD)試驗(yàn)組和低劑量灌胃2mg/(kg.d)(DM-LD)試驗(yàn)組，每組各8只，連續(xù)灌胃28 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)定糖尿病試驗(yàn)大鼠血清、肝臟、骨骼肌和空腸等組織中與機(jī)體蛋白質(zhì)代謝直接相關(guān)的生理生化指標(biāo)、代謝酶的酶活和激素水平等的含量與變化；并采用qPCR和western-blot等技術(shù)檢測(cè)大鼠肝臟及骨骼肌中與蛋白質(zhì)合成與分解代謝相關(guān)基因mRNA

19、及蛋白表達(dá)量，來(lái)探討花椒麻素對(duì)蛋白質(zhì)代謝紊亂的糖尿病試驗(yàn)大鼠的蛋白質(zhì)代謝影響與機(jī)制，以進(jìn)一步闡明花椒麻素對(duì)試驗(yàn)大鼠蛋白質(zhì)代謝的影響與機(jī)制。結(jié)果表明，花椒麻素可顯著(P＜0.05)降低糖尿病試驗(yàn)大鼠空腹血糖和果糖胺的含量，可緩解因糖尿病誘導(dǎo)的臟器腫大；顯著(P＜0.05)增加骨骼肌重量，顯著(P＜0.05)升高血清胰島素、IGF-I、總蛋白、白蛋白含量及球蛋白/白蛋白比值。顯著(P＜0.05)增加骨骼肌總蛋白、RNA含量及RNA/DNA比

20、值；可顯著(P＜0.05)上調(diào)肝臟和骨骼肌IGF-I，IGF-IR和InR mRNA表達(dá)量；顯著(P＜0.05)上調(diào)骨骼肌PI3K、PKB和mTOR mRNA表達(dá)量；顯著(P＜0.05)下調(diào)骨骼肌atrogin-1/MAFbx、MURF1和FoxO mRNA表達(dá)量；顯著(P＜0.05)上調(diào)骨骼肌mTOR(total)、p-mTOR(ser2448、PKB(total)、p-PKB(ser437)和 PI3K(p110)蛋白水平；顯著(P

21、＜0.05)下調(diào)骨骼肌中atrogin-1/MAFbx、MURF1和 FoxO蛋白表達(dá)量。結(jié)果提示：花椒麻素可改善因STZ誘導(dǎo)所致糖尿病大鼠機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝紊亂，其中高劑量試驗(yàn)組和中劑量試驗(yàn)組改善糖尿病大鼠機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝紊亂的效果顯著(P＜0.05)好于低劑量試驗(yàn)組。其機(jī)制可能為：花椒麻素可由 Ins/IGF-I→PI3K→PKB→mTOR信號(hào)通路增加糖尿病試驗(yàn)大鼠蛋白質(zhì)合成，并通過(guò)UPP途徑降低蛋白質(zhì)的分解。
　?、苫ń仿樗貙?duì)

22、糖尿病大鼠骨骼肌AMPK途徑的影響研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)定糖尿病試驗(yàn)大鼠血清和肝臟中TG(triglyceride)、MDA(malondialdehyde)、TC(total cholesterol)和FFA(free fatty acid)含量及變化；并采用 qPCR和 western-blot檢測(cè)糖尿病試驗(yàn)大鼠骨骼肌中AMPK、SIRT1、ACC、GLUT4等相關(guān)基因mRNA及蛋白表達(dá)量，以探討花椒麻素對(duì)糖尿病大鼠骨骼肌AMPK途徑

23、的影響及潛在機(jī)制。結(jié)果表明，花椒麻素可顯著(P＜0.05)降低糖尿病試驗(yàn)大鼠血清中 TG、MDA和FFA含量，顯著(P＜0.05)降低肝臟的TC、TG和MDA的含量。 qPCR和western-blot檢測(cè)表明，花椒麻素對(duì)糖尿病試驗(yàn)大鼠骨骼肌AMPK mRNA有上調(diào)趨勢(shì)，但不顯著(P＞0.05)；但顯著(P＜0.05)上調(diào)AMPK和p-AMPK(Thr172)蛋白質(zhì)表達(dá)，顯著(P＜0.05)上調(diào)ACC mRNA表達(dá)和p-ACC(Ser7

24、9)蛋白質(zhì)表達(dá)，同時(shí)顯著(P＜0.05)上調(diào)糖尿病大鼠骨骼肌細(xì)胞膜上GLUT4 mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果提示：花椒麻素可激活糖尿病大鼠骨骼肌 AMPK信號(hào)通路，抑制 ACC活性減少脂肪酸的形成；同時(shí)通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路介導(dǎo)GLUT4快速轉(zhuǎn)位，提高葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)速率，降低血糖。因此，花椒麻素可通過(guò)激活A(yù)MPK途徑，改善糖尿病大鼠糖、脂及蛋白質(zhì)代謝紊亂。花椒麻素對(duì)糖尿病大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成增加是 Ins/IGF-I→PI3K→PKB途徑和A