PAI-1-RNAi對(duì)SD大鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)探討應(yīng)用RNA干擾（RNA Interference, RNAi）技術(shù)下調(diào)纖溶酶原激活抑制劑-1（Plasminogen Activator Inhibitor-1，PAI-1）表達(dá)對(duì)SD大鼠皮膚成纖維細(xì)胞（fibroblast）增殖的影響，通過體外實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平探究 PAI-1對(duì)成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化的作用，進(jìn)一步為前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn) PAI-1 siRNA可改善 SD大鼠瘢痕疙瘩模型提供理論依據(jù)，為瘢痕疙瘩（keloid）基因治

2、療開辟新思路。
　　方法：
　　1.SD大鼠皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)
　　采用組織塊培養(yǎng)法獲取原代 SD大鼠皮膚成纖維細(xì)胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)去除上皮細(xì)胞、紅細(xì)胞等雜質(zhì)成分，獲取單一成纖維細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)變化。
　　2.免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定細(xì)胞
　　應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法，通過檢測(cè)波形蛋白表達(dá)是否陽(yáng)性，鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞是否為成纖維細(xì)胞。
　　3.PAI-1 siRNA轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，并進(jìn)行

3、實(shí)驗(yàn)分組
　　利用脂質(zhì)體（Lipofectamine2000）轉(zhuǎn)染 siRNA至體外培養(yǎng)傳代至第六代的成纖維細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染不同設(shè)置實(shí)驗(yàn)分組為：轉(zhuǎn)染 PAI-1 siRNA的實(shí)驗(yàn)組、轉(zhuǎn)染 NC siRNA的陰性對(duì)照組、不進(jìn)行轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組。
　　4.應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24小時(shí)，PAI-1 mRNA、TGF-β1 mRNA的表達(dá)。
　　5.應(yīng)用 Western blot法測(cè)定轉(zhuǎn)染48小時(shí)，PAI-1、AKT、ER

4、K、p-AKT、p-ERK蛋白的表達(dá)。
　　6.應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)細(xì)胞并繪制曲線。
　　分別于轉(zhuǎn)染24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，制備細(xì)胞懸液進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)以及未被染液染色的細(xì)胞總數(shù)（或被染色的細(xì)胞總數(shù)），以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞計(jì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及成纖維細(xì)胞成活率曲線。
　　7.應(yīng)用CCK-8測(cè)定成纖維細(xì)胞的增殖活力繪制曲線。
　　分別于轉(zhuǎn)染24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)加入C

5、CK-8試劑，孵育4小時(shí)后，通過使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定吸光度（OD值），根據(jù)計(jì)算公式，得出細(xì)胞的OD值、細(xì)胞增殖抑制百分率（％）。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞的OD值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線；以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞增殖抑制百分率（%）為縱坐標(biāo)繪制增殖抑制率曲線。
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)應(yīng)用 SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以 P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)行數(shù)據(jù)分析

6、之前，先分析數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性。若數(shù)據(jù)服從正態(tài)性分布且方差齊時(shí)，則多樣本比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較采用 SNK-q檢驗(yàn)；若不服從正態(tài)性分布或方差不齊，則選用秩和檢驗(yàn)中的Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，組間比較采用 Mann-Whitney U檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1.采用組織塊培養(yǎng)法成功獲取 SD大鼠皮膚成纖維細(xì)胞，經(jīng)傳代至第5-6代可獲取單一成分的成纖維細(xì)胞；
　　2.

7、采用免疫細(xì)胞化學(xué)法染色檢測(cè)波形蛋白，鏡下可見培養(yǎng)細(xì)胞胞漿顯示棕色或棕黃色顆粒，細(xì)胞核未見著色，即波形蛋白抗體染色陽(yáng)性，證實(shí)實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)細(xì)胞是成纖維細(xì)胞；
　　3.應(yīng)用 Real time PCR檢測(cè) PAI-1成功轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞中 PAI-1 mRNA、 TGF-β1 mRNA表達(dá)明顯降低，三組間 RQ值總體均數(shù)不同或不全相同（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組間、實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而

8、陰性對(duì)照與空白組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；
　　4.應(yīng)用 Western blot檢測(cè)成功轉(zhuǎn)染 PAI-1 siRNA，成纖維細(xì)胞中PAI-1、p-AKT、p-ERK蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組間、實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而陰性對(duì)照與空白組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而對(duì)去磷酸化狀態(tài) AKT、ERK無(wú)影響，三組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；
　　5.臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)細(xì)

9、胞，繪制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及成活率曲線可見隨著時(shí)間進(jìn)展轉(zhuǎn)染 PAI-1 siRNA后成纖維細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)速度較陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組明顯減慢，細(xì)胞成活率顯著降低；
　　6.采用 CCK-8試劑測(cè)定繪制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及成纖維細(xì)胞增殖抑制率曲線，觀察走勢(shì)，與對(duì)照組相比可見轉(zhuǎn)染 PAI-1 siRNA后的成纖維細(xì)胞增殖活力低，增殖抑制率較高。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)研究成功獲取原代 SD大鼠皮膚成纖維細(xì)胞，選取傳代至第五或