小鼠脾臟基質和B淋巴細胞的增齡性變化及同種異基因骨髓間充質干細胞移植對其的影響.pdf

1、目的：
　　1.檢測BALB/c小鼠脾臟基質的增齡性變化，探討β-catenin信號分子在脾臟基質老化中的作用。
　　2.檢測BALB/c小鼠脾臟B淋巴細胞比例、B淋巴細胞亞群比例和增殖、凋亡、周期相關基因mRNA表達水平的增齡性變化，探討基質老化對B細胞老化的影響。
　　3.探索C57BL/6J小鼠來源的同種異基因骨髓間充質干細胞移植對BALB/c小鼠脾臟基質和B細胞老化的影響。
　　方法：
　　1.將雌

2、性BALB/c小鼠分別按照2-4月齡、8-10月齡和18-20月齡定義為青年組、中年組和老年組。蘇木精-伊紅染色觀察不同年齡組小鼠脾臟的組織學特征;天狼星紅染色檢測脾臟中膠原分布情況;免疫組織化學法檢測脾臟collagenⅠ、elastin、fibronectin的蛋白表達情況。
　　2.實時熒光定量PCR(Real-time PCR)法檢測不同年齡組BALB/c小鼠脾臟基質成分agrin、cogegeⅠα1、collegenⅢα

3、1、collegenⅣα1、collegenⅥα1、elastin、fibrillin1、fibronectin1、fibulin1、lamininα5、MMP-2的mRNA表達水平，β-catenin信號分子及其上游調控子DVL2、DVL3、CK1、GSK-3β，下游轉錄子TCF4，靶基因PPARδ、Axin2、c-myc、cyclin D1的mRNA相對表達量，蛋白質印跡法(Western blot)檢測β-catenin和CK1的

4、蛋白表達情況，Real-time PCR法檢測B細胞標記CD19的mRNA相對表達量。
　　3.制備脾臟單細胞懸液，流式細胞術檢測不同年齡組BALB/c小鼠脾臟CD19+B淋巴細胞比例及B細胞中CD19+ CD5+、CD19+ CD24+、CD19+IgM+IgD-和CD19+IgD+細胞亞群的比例。
　　4.流式細胞術分選、收集脾臟B淋巴細胞，Real-time PCR法檢測B細胞中增殖相關基因Ki-67，凋亡相關基因Ba

5、x、Bcl-2、Caspase3、Caspase8，細胞周期相關基因cyclinD1、cyclinE1、p16INK4a，抗原決定簇分子CD5、CD24，β-catenin信號分子及其上游調控子DVL2、DVL3、CK1、GSK-3β，下游轉錄子TCF4，靶基因PPARδ、Axin2、c-myc的mRNA相對表達量。
　　5.骨片消化法分離、培養(yǎng)C57BL/6J小鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)。
　　6.通過尾靜脈向實驗組

6、小鼠體內注射BMSCs，每2周注射一次，連續(xù)注射4次，單次注射量1×106個細胞（懸于100μl PBS），末次注射后2周取材，重復檢測上述脾臟基質和B細胞老化相關指標的變化。
　　結果：
　　第一部分
　　1.老年組小鼠脾臟組織結構紊亂，含鐵血黃素顆粒和Ⅰ型膠原沉積較青年組增加。
　　2.老年組小鼠脾臟基質成分agrin、collagenⅠα1、collagenⅢⅢα1、collagenⅣα1、elastin和

7、fibrillin1的mRNA相對表達量顯著低于青年組小鼠(P＜0.01或P＜0.05);collagenⅥα1、fibronectin1、fibulin1、lamininα5和MMP2的mRNA相對表達量與青年組小鼠無統(tǒng)計學差異。
　　3.老年組小鼠脾臟β-catenin信號分子及其上游調控子CK1的mRNA和蛋白表達水平均低于青年組（P＜0.05或P＜0.01），下游靶基因PPARδ、cyclin D1、CD44的mRNA表達

8、水平顯著低于青年組（P＜0.01或P＜0.05）;其他調控子DVL2、DVL3、GSK-3β，下游轉錄子TCF4，靶基因Axin2的mRNA相對表達量均值低于青年組，但未達到統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　4.經(jīng)過4次C57BL/6J小鼠來源的同種異基因BMSCs移植后，老年組BALB/c小鼠脾臟基質成分collagenⅢα1的mRNA表達顯著上調(P＜0.01)，collagenⅣα1和fibronectin1的mRNA表達下

9、調(P＜0.05和P＜0.01);β-catenin信號分子的下游轉錄子TCF4和靶基因CD44 mRNA表達上調(P＜0.05)，其余相關基因表達無明顯變化。
　　第二部分
　　1.不同年齡組BALB/c小鼠脾臟中B淋巴細胞比例無顯著差異，老年組小鼠脾臟B細胞中CD19+ CD5+、CD19+ IgD+細胞亞群比例顯著高于青年組(P＜0.01)，CD19+ CD24+、CD19+ IgM+ IgD-細胞亞群比例顯著低于青年

10、組(P＜0.01)。老年組脾臟B細胞中CD24、Ki-67的mRNA表達水平顯著低于青年組(P＜0.01)，CD5、Bcl-2、caspase8和p16INK4α的mRNA表達水平顯著高于青年組(P＜0.05或P＜0.01)，Bax、caspase3、cyclinD1和cyclin E1的mRNA表達水平與青年組無統(tǒng)計學差異。
　　2.不同年齡組BALB/c小鼠脾臟B細胞中β-catenin信號分子及其上游調控子DVL2、DVL3

11、、CK1，下游靶基因PPARδ、CD44、Axin2的mRNA表達水平無統(tǒng)計學差異。
　　3.經(jīng)過4次C57BL/6J小鼠來源的同種異基因BMSCs移植后，老年組小鼠脾臟B細胞比例和CD19的mRNA表達水平顯著升高(P＜0.01);B細胞中CD19+CD5+、CD19+ CD24+和CD19+ IgD+亞群比例顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）;Ki-67和p16INK4α的mRNA表達水平上調(P＜0.01)，CD5、CD

12、24和Caspase8的mRNA表達水平下調(P＜0.05)，其余基因表達無明顯變化。
　　結論：
　　1.小鼠脾臟基質老化表現(xiàn)為多種細胞外基質成分的mRNA表達水平下調。
　　2.β-catenin信號分子對脾臟基質老化有重要作用。
　　3.隨著年齡增加，小鼠脾臟B淋巴細胞比例維持穩(wěn)定，但增殖活性降低，部分亞群比例發(fā)生改變，可能與基質老化有關。
　　4.同種異基因骨髓間充質干細胞移植可以影響部分老化相關的