擬南芥AtSRT2基因的克隆及抗鹽堿性分析.pdf

1、組蛋白可以在磷酸化酶/去磷酸化酶、乙?；?去乙酰化酶、甲基化酶/去甲基化酶等的作用下發(fā)生多種修飾作用，不同的修飾作用通過改變組蛋白與DNA的結(jié)合情況，進(jìn)而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄水平，以便參與到調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，影響染色質(zhì)穩(wěn)定性，參與生長、發(fā)育、分化、衰老等生理過程。沉默調(diào)節(jié)蛋白Sirtuin是一種依賴NAD+的特殊組蛋白去乙酰化酶，通過NAD+的合成與分解來調(diào)控細(xì)胞能量代謝以及氧化還原狀態(tài)。Sirtuin蛋白在動物和酵母中研究的較多，參與延長

2、細(xì)胞壽命，DNA損傷修復(fù)、保持基因組穩(wěn)定性以及能量代謝等過程。但植物中存在較少，擬南芥中僅有AtSRT1和AtSRT2，功能尚不完全清楚。已有研究報道，Sir2家族與植物發(fā)育、生物脅迫以及激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面有一定的關(guān)系，但與非生物逆境的關(guān)系與作用機(jī)制未有報道。
　　本試驗(yàn)利用RT-PCR方法從哥倫比亞生態(tài)型擬南芥中克隆得到AtSRT2基因(AT5G55760)，開放閱讀框片段為1122bp，編碼373個氨基酸，通過Gateway方

3、法構(gòu)建植物表達(dá)載體pGWB2-AtSRT2，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥中，成功獲得了超表達(dá)轉(zhuǎn)基因T2代。將獲得的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系(AtSRT2)與野生型(WT)、轉(zhuǎn)入空載體的擬南芥(pGWB2)以及突變體(atsrt2)進(jìn)行分析，觀察在不同鹽堿脅迫處理后生理生化指標(biāo)及其表型的變化。
　　通過實(shí)驗(yàn)得出以下的結(jié)論:
　　1.通過檢測在120mmol/LNaCl脅迫和5mmol/LNaHCO3脅迫下種子萌發(fā)率，葉片、

4、根長、以及鮮重，我們發(fā)現(xiàn)AtSRT2組的擬南芥在不同的脅迫處理?xiàng)l件下，萌發(fā)率都能達(dá)到100％，相反atsrt2表現(xiàn)為萌發(fā)較晚甚至不萌發(fā)，5mmol/LNaHCO3脅迫下萌發(fā)率最低，在75％左右;120mmol/LNaCl下AtSRT2組的根長為3.22cm，約是WT組、pGWB2組、atsrt2組的1.25倍、1.19倍、1.56倍，5mmol/LNaHCO3下根長為2.94cm，約是其它三組的1.35倍、1，28倍、1.64倍;此外，

5、葉片大小和鮮重也都大于其他三組，120mmol/L NaCl下，AtSRT2組的鮮重為37.9mg，約是WT組、pGWB2組、atsrt2組1.22倍、1.26倍、1.79倍，5mmol/L NaHCO3 AtSRT2組的鮮重為32.1mg，約是WT組、pGWB2組、atsrt2組的1.53倍、1.39倍、1.80倍。
　　2.通過0、60、120、180mmol/LNaCl溶液和0、3、5、7mmol/LNaHCO3溶液脅迫處理

6、四組擬南芥，發(fā)現(xiàn)對照組的四組擬南芥中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸、可溶性蛋白的含量含量無明顯的差別，然而隨著鹽堿濃度的升高，脯氨酸和可溶性蛋白含量呈上升的趨勢。在180mmol/LNaCl時達(dá)到最大值，AtSRT2組脯氨酸的含量比WT組、pGWB2組、atsrt2組高18.6％、21.1％、34.4％，AtSRT2組可溶性蛋白含量分別比其他三組高了29.8％、28.3％、100％;7mmol/LNaHCO3時含量達(dá)到最高，脯氨酸的含量比WT組、

7、pGWB2組、atsrt2組高31.6％、20.8％、45.1％，可溶性蛋白比WT組、pGWB2組、atsrt2高了41.1％、34.5％、73.0％。
　　3.在60mmol/L的NaCl處理時，WT組、pGWB2組、atsrt2組的相對電導(dǎo)率比ATSRT2組高26.3％，10.7％、48.3％;在180mmol/L時，WT組、pGWB2組、atsrt2組的相對電導(dǎo)率比AtSRT2組高8.6％、12.4％、24.9％;在3mmo

8、l/LNaHCO3處理下，WT組、pGWB2組、atsrt2組的相對電導(dǎo)率比AtSRT2組高26.1％，18.4％、41.1％，在7mmol/L時，分別比AtSRT2組高了24.0％、21.8％、54.7％。隨著鹽堿濃度的升高，相對電導(dǎo)率也呈上升的趨勢，但是超表達(dá)轉(zhuǎn)基因組上升幅度較小，突變組上升幅度最大。
　　4.在60mmol/LNaCl處理時，AtSRT2組分別比WT組、pGWB2組、atsrt2組高4％、6.8％、11.4％

9、，在180mmol/L Na Cl處理下，分別比其他三組高了43.8％、31.4％、119％;3mmol/LNaHCO3下AtSRT2組分別比WT組、pGWB2組、atsrt2組高11.6％、8.5％、20.3％，7mmol/L的NaHCO3下，AtSRT2組分別比WT組、pGWB2組、atsrt2組高45.2％、60.7％、104％。葉綠素的含量隨著鹽堿脅迫濃度的增加，呈下降趨勢，但是AtSRT2組的葉綠素含量最高的，野生型和空載體組

10、高于突變體。
　　5.此外，還進(jìn)一步檢測了脅迫對不同擬南芥植株的抗氧化酶的影響，通過測定SOD、POD的酶活力發(fā)現(xiàn)，在沒有脅迫處理的對照組四組擬南芥的酶活力沒有明顯的差別，但是SOD、POD酶活隨著鹽和堿濃度的升高而升高，AtSRT2組的酶活力高于其他三組，突變體酶活力最低，當(dāng)鹽濃度在120mM時，SOD酶活差別最顯著，AtSRT2組分別是WT組、pGWB2組、atsrt2組1.38倍、1.30倍、1.53倍，堿濃度在7mM時SO

11、D酶活差別最顯著，AtSRT2組分別是WT組、pGWB2組、atsrt2組1.23倍、1.32倍、1.60倍;POD酶活在鹽濃度為180mM時差異最明顯，AtSRT2組分別是WT組、pGWB2組、atsrt2組1.32、1.26、1.67倍，堿濃度達(dá)到7mM最顯著，AtSRT2組分別是WT組、pGWB2組、atsrt2組1.23、1.32、1.37倍。
　　通過上述研究，我們對AtSRT2基因的功能以及與非生物脅迫的關(guān)系有了更深的