乳酸菌高效膜蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及其自溶性質(zhì)的研究.pdf

1、乳酸菌是一類(lèi)能夠利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的統(tǒng)稱，是一群由多個(gè)屬組成的龐雜細(xì)菌群體，主要包括乳球菌屬(Lactococcus)，乳桿菌屬（Lactobacillus），片球菌屬(Pediococcus)，鏈球菌屬(Streptococcus)，腸球菌屬(Enterococcus)，雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)等。大多數(shù)乳酸菌對(duì)人體有益，它們通過(guò)降解糖類(lèi)、蛋白和脂肪產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)促進(jìn)人體健康。此外，大部分

2、乳酸菌本身就是益生菌(probiotics)，其益生性質(zhì)體現(xiàn)在維持人體腸道菌群平衡、調(diào)節(jié)人體免疫以及抑制有害病原微生物的生長(zhǎng)等多個(gè)方面。
　　 乳酸菌有些益生功能與細(xì)菌表面性質(zhì)有關(guān)，比如絮凝(aggregation)、黏附(adhesion)、自溶(autolysis)等。自溶（自裂解），是指細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖的某個(gè)階段因肽聚糖水解酶（自溶酶）的作用而引起的自身裂解的現(xiàn)象。自溶酶除了裂解細(xì)胞發(fā)生自溶外，還參與細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的多個(gè)生理過(guò)

3、程，如新合成肽聚糖的延伸、細(xì)胞增大以及子代細(xì)胞的產(chǎn)生等，是一類(lèi)極其重要的細(xì)胞壁水解酶類(lèi)。研究表明，有些抗生素、細(xì)菌素的抗菌作用也是通過(guò)肽聚糖水解酶的活性而完成的，因此對(duì)肽聚糖水解酶的深入認(rèn)識(shí)對(duì)于揭示乳酸菌的益生作用以及充分發(fā)揮抗生素的殺菌作用尤為重要。
　　 除了作為益生菌劑，乳酸菌還是重要的工業(yè)微生物菌株，在食品加工、乳制品發(fā)酵等領(lǐng)域具有悠久的應(yīng)用歷史，是公認(rèn)的安全級(jí)(GenerallyRegardedasSafe，GRAS)

4、微生物。有些乳酸乳球菌和乳桿菌作為發(fā)酵劑廣泛應(yīng)用于奶酪的生產(chǎn)。其中，奶酪的成熟過(guò)程是一個(gè)緩慢而昂貴的過(guò)程，而乳酸菌發(fā)酵劑的自溶釋放出的脂肪酶、蛋白酶有利于風(fēng)味物質(zhì)的形成和奶酪的成熟，因此實(shí)時(shí)控制和深入認(rèn)識(shí)自裂解機(jī)制是加速奶酪成熟的有效手段。截至目前，很多研究都著重于通過(guò)基因工程的方法構(gòu)建可控裂解的乳酸乳球菌發(fā)酵劑菌株從而達(dá)到控制與縮短奶酪成熟時(shí)間的目的。而遺憾的是，發(fā)酵劑菌株的過(guò)度裂解會(huì)導(dǎo)致正常細(xì)胞數(shù)量減少，從而引起乳糖的過(guò)量剩余和奶酪

5、性質(zhì)的不穩(wěn)定。所以，在非發(fā)酵劑菌株（主要指乳酸桿菌）中構(gòu)建可控裂解系統(tǒng)可有效避免上述問(wèn)題的發(fā)生。
　　 乳酸菌基因組小、代謝簡(jiǎn)單、蛋白酶活力弱、易于進(jìn)行人工改造等特征使其成為微生物學(xué)及分子生物學(xué)研究中的重要模式菌株。其中乳酸乳球菌已建立起較完善的遺傳操作系統(tǒng)，利用嚴(yán)謹(jǐn)型啟動(dòng)子NisA可控表達(dá)系統(tǒng)(thenisin-controlledexpression，NICE)已實(shí)現(xiàn)了多種異源蛋白的表達(dá)。由于乳酸菌是單分子膜，遺傳操作系統(tǒng)可

6、控性強(qiáng)，它還是膜蛋白表達(dá)的良好宿主。
　　 本論文主要以乳酸乳球菌與干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)為實(shí)驗(yàn)材料，以自溶性質(zhì)以及膜蛋白表達(dá)為研究重點(diǎn)，構(gòu)建了一個(gè)新的高效乳酸菌膜蛋白表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了綠色巴夫藻△4去飽和酶和嗜酸乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶在乳球菌中的過(guò)量表達(dá);并且對(duì)乳酸菌的自溶性質(zhì)以及相關(guān)肽聚糖水解酶的鑒別與生物特性進(jìn)行了研究和探討。具體的工作內(nèi)容和取得的結(jié)果如下:
　　 1.多不飽和脂肪酸合成相關(guān)功

7、能基因的克隆與表達(dá)
　　 多不飽和脂肪酸是人體所必需卻不能自然合成的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其相關(guān)合成基因的克隆和表達(dá)是研究者關(guān)心的熱點(diǎn)。本文以綠色巴夫藻(Pavlovaviridis)為材料，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄、SEFA-PCR(self-formedadaptorPCR)、SOE(splicingbyoverlapextension)等方法分別擴(kuò)增得到了在EPA（二十碳五烯酸）與DHA（二十二碳六烯酸）合成中起重要作用的△5去飽和酶和△4去飽

8、和酶的基因全長(zhǎng)及表達(dá)序列。與之前實(shí)驗(yàn)室克隆和特征化的C20延伸酶（△5延伸酶）一起，完成了對(duì)綠色巴夫藻中EPA和DHA合成所涉關(guān)鍵基因的全部克隆工作。其中，△4去飽和酶與其同源蛋白有75％的同源序列。為了研究該酶的性質(zhì)，在嘗試以大腸桿菌和畢赤酵母為宿主利用多種載體表達(dá)△4去飽和酶時(shí)均沒(méi)有成功，主要原因是膜蛋白的過(guò)量表達(dá)對(duì)宿主細(xì)胞有毒害作用。隨后，將來(lái)源于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、能夠自動(dòng)折疊于細(xì)胞膜的整合型膜蛋白

9、短肽Mistic與△4去飽和酶進(jìn)行融合連接，結(jié)果實(shí)現(xiàn)了△4去飽和酶在大腸桿菌的過(guò)量表達(dá)。目的蛋白條帶在SDS-PAGE中顯著可見(jiàn)，此研究成為真核微藻多不飽和脂肪酸去飽和酶基因在原核生物中高效表達(dá)的首個(gè)成功例證。
　　 2.乳酸乳球菌高效膜蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建與應(yīng)用
　　 膜蛋白對(duì)真核與原核細(xì)胞的生命活動(dòng)具有重要作用，比如信號(hào)傳導(dǎo)、能量轉(zhuǎn)換、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等。在已測(cè)序的基因組中，膜蛋白占據(jù)所有開(kāi)放閱讀框(ORF)的20％到25

10、％。可是相比于可溶蛋白的研究，已明確結(jié)構(gòu)特征和生化基礎(chǔ)的膜蛋白數(shù)量很少，而通過(guò)異源表達(dá)制備具有高分辨率結(jié)構(gòu)的膜蛋白則更是屈指可數(shù)。阻礙膜蛋白研究的一個(gè)重要瓶頸就是膜蛋白過(guò)量表達(dá)。在Mistic介導(dǎo)△4去飽和酶在大腸桿菌表達(dá)工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步以乳酸乳球菌為宿主，以pNZ8148為骨架，結(jié)合Mistic結(jié)構(gòu)元件構(gòu)建了一個(gè)膜蛋白表達(dá)載體pNM110，探討和改進(jìn)膜蛋白在乳酸乳球菌中的表達(dá)。通過(guò)Mistic與GFP的融合表達(dá)和GFP熒光的檢測(cè)，

11、證實(shí)了短肽Mistic可以成功插入乳酸乳球菌的細(xì)胞膜，并且具有促進(jìn)膜蛋白過(guò)量表達(dá)的潛力。為了驗(yàn)證該載體在乳球菌中表達(dá)膜蛋白的有效性，將克隆自綠色巴夫藻的△4去飽和酶基因pkjDes4和嗜酸乳桿菌的亞油酸異構(gòu)酶基因pkjLi分別與Mistic融合連接，構(gòu)建了重組載體pNMDes4和pNMLi，并成功實(shí)現(xiàn)了上述兩種膜蛋白在乳酸乳球菌中的過(guò)量表達(dá)，其表達(dá)水平分別達(dá)到了膜蛋白總量的4.4％與45.2％，這個(gè)表達(dá)水平是目前以乳酸乳球菌為宿主表達(dá)膜

12、蛋白產(chǎn)量最高的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證所表達(dá)亞油酸異構(gòu)酶的功能，將重組的乳酸乳球菌菌株與底物亞油酸在一定條件下培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組乳酸菌具有轉(zhuǎn)化亞油酸生成共軛亞油酸的能力，產(chǎn)量可達(dá)0.852mg/ml，轉(zhuǎn)化率為28.4％，該結(jié)果首次實(shí)現(xiàn)了乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶的異源表達(dá)和功能鑒定。
　　 3.乳酸菌自溶性質(zhì)的研究
　　 細(xì)菌編碼的自溶酶除了用于細(xì)胞分裂產(chǎn)生子代細(xì)胞外，對(duì)于乳酸菌來(lái)說(shuō)，還有一個(gè)重要的作用是在乳酪成熟中釋放出胞內(nèi)水解酶類(lèi)而

13、有助于風(fēng)味物質(zhì)的形成和縮短成熟時(shí)間;同時(shí)自溶酶具有對(duì)病原微生物的殺菌效果而可作為殺菌劑用作菌種保藏。因此對(duì)自溶酶和自溶表型的研究為乳酸菌的研究熱點(diǎn)之一。本文采用GM17和MRS選擇培養(yǎng)基，結(jié)合不同培養(yǎng)條件，先后從發(fā)酵乳、雞腸道和人糞便等不同生境中分離得到了多株乳酸菌并對(duì)其自溶能力進(jìn)行了測(cè)量和篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同種細(xì)菌不同菌株之間的自溶能力有顯著差異，這說(shuō)明自溶具有高度菌株特異性。此外，糞腸球菌的自溶能力明顯強(qiáng)于乳酸乳球菌。以抗生素為代表的

14、生長(zhǎng)抑制劑的使用是誘發(fā)細(xì)菌自溶現(xiàn)象的一個(gè)重要途徑。本文檢測(cè)了多種生長(zhǎng)抑制劑在不同生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)乳酸乳球菌自溶性質(zhì)的影響。結(jié)果表明，某些抗生素能夠在碳源嚴(yán)格限制性培養(yǎng)基中對(duì)處于特定生長(zhǎng)時(shí)期的乳酸乳球菌產(chǎn)生顯著裂解的現(xiàn)象，而且抑制細(xì)胞壁合成類(lèi)抗生素的促自溶效果更為明顯，這些結(jié)果對(duì)于研究抗生素與乳酸菌自溶的關(guān)系以及乳酸菌自溶的調(diào)控機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 4.干酪乳桿菌肽聚糖水解酶AclB的鑒別與生物特性研究
　　 相比于乳酸乳

15、球菌，除了植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）的Acm2外，尚無(wú)乳桿菌肽聚糖水解酶鑒別與生物特性研究的報(bào)道。本文以干酪乳桿菌為研究對(duì)象，鑒別并克隆到5種推定的肽聚糖水解酶（自溶酶）基因，并對(duì)非內(nèi)肽酶的基因在指數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期的不同階段的表達(dá)情況做了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)它們?cè)谥笖?shù)期的轉(zhuǎn)錄量有著相似的變化趨勢(shì)。隨后，AclA與AclB分別在大腸桿菌中進(jìn)行了大量表達(dá)和純化。酶活性質(zhì)測(cè)定表明，AclB在pH5.0的酸性條件下具有最大的水解

16、活性，而最適溫度是37℃，此結(jié)果與乳酸乳球菌肽聚糖水解酶AcmB、AcmC的酶活性質(zhì)相似。為了研究AclB在細(xì)胞分離中的作用，使用自殺性整合載體對(duì)干酪乳桿菌S1的AclB基因進(jìn)行了敲除失活。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除后的乳桿菌除了在自溶能力以及自絮凝能力上有變化外，最顯著的特征是部分突變菌體拉長(zhǎng)或者扭曲，表明AclB在細(xì)胞分裂后的分離中起著重要的作用。本文首次對(duì)乳桿菌的肽聚糖水解酶做了全面的鑒別和分析，并首次對(duì)干酪乳桿菌中的AclB酶進(jìn)行了生物特性研

17、究，為該菌株的后續(xù)應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 5.干酪乳桿菌可控裂解系統(tǒng)的建立及在奶酪發(fā)酵中的潛在應(yīng)用
　　 干酪乳桿菌作為發(fā)酵劑或非發(fā)酵劑乳酸菌株(non-starterlacticacidbacteria，NSLAB)應(yīng)用于切達(dá)奶酪等多種奶酪的發(fā)酵生產(chǎn)中。建立干酪乳桿菌可控裂解系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)酶的快速釋放，同時(shí)可保持發(fā)酵劑一定的活細(xì)胞數(shù)，是加快奶酪成熟的有效途徑。本文選用了來(lái)自于乳酸乳球菌的AcmA與來(lái)自于糞腸球菌的A

18、tlA兩種自溶酶，以NICE系統(tǒng)為基礎(chǔ)，以干酪乳桿菌為宿主分別構(gòu)建了兩個(gè)可控裂解體系。在nisin的誘導(dǎo)下，AcmA與AtlA均能夠成功表達(dá)并水解細(xì)胞壁，從而裂解干酪乳桿菌細(xì)胞并釋放出胞內(nèi)蛋白。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該體系在奶酪生產(chǎn)中的應(yīng)用潛力，我們進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的模擬奶酪實(shí)驗(yàn)，在使用AtlA裂解體系的奶酪凝乳中檢測(cè)到了5倍于對(duì)照組的乳酸脫氫酶活性，這標(biāo)志著更多的胞內(nèi)酶在生產(chǎn)過(guò)程中被釋放到凝乳中。此外，在整個(gè)模擬奶酪實(shí)驗(yàn)中，所使用的發(fā)酵菌株乳