NaC1處理下幾種紅樹(shù)植物滲透調(diào)節(jié)特征和蛋白表達(dá)差異研究及擬南芥AtNHX的亞細(xì)胞定位.pdf

1、紅樹(shù)植物由于長(zhǎng)期生活在高鹽度的海水環(huán)境中，具有十分有效的耐鹽機(jī)制，是研究植物尤其是木本植物耐鹽機(jī)理的絕好材料。本文研究了不同濃度NaCl處理對(duì)秋茄(Kandelia candel)、木欖(Bruguiera gymnorrhiza)、白骨壤(Avicenniamarina)和桐花樹(shù)(Aegiceras corniculatum)四種紅樹(shù)植物葉片滲透調(diào)節(jié)特征的影響；分析了不同濃度NaCl處理45 d后三種紅樹(shù)植物(秋茄、桐花樹(shù)和木欖)葉片

2、的蛋白質(zhì)組；研究了模式植物擬南芥Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtNHX2、AtNHX3、AtNHX5和AtNHX6的亞細(xì)胞定位。主要結(jié)論如下：
　　 1.本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同鹽濃度處理下四種紅樹(shù)植物幼苗葉片的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)中分別采用無(wú)鹽(0 mM NaCl)、中等鹽度(200 mM NaCl)和高鹽度(用500 mM NaCl處理秋茄、木欖和桐花樹(shù)；600 mM NaCl處理白骨壤)三種不同的鹽濃度，分別在鹽處理后0、7、15

3、、30和45 d取樣，分析四種紅樹(shù)植物葉片中各種無(wú)機(jī)離子和有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，以及它們對(duì)總滲透勢(shì)的貢獻(xiàn)率，并比較了非泌鹽紅樹(shù)與泌鹽紅樹(shù)在滲透調(diào)節(jié)機(jī)制上的異同。
　　 研究結(jié)果表明，非泌鹽紅樹(shù)與泌鹽紅樹(shù)表現(xiàn)出不同的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制，即在高鹽度處理下，無(wú)機(jī)離子對(duì)泌鹽紅樹(shù)植物的滲透調(diào)節(jié)貢獻(xiàn)作用比非泌鹽紅樹(shù)植物更加重要，高鹽度處理45 d后，無(wú)機(jī)離子貢獻(xiàn)率在泌鹽紅樹(shù)植物中平均比非泌鹽紅樹(shù)植物中高出約16％，并且，非泌鹽紅樹(shù)植物的無(wú)機(jī)離子

4、貢獻(xiàn)率在高鹽度處理下低于中等鹽度處理。該結(jié)果表明非泌鹽紅樹(shù)植物對(duì)Na+和Cl-的耐受能力低于泌鹽紅樹(shù)，在高鹽度下更多轉(zhuǎn)向?qū)τ袡C(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，而泌鹽紅樹(shù)植物體內(nèi)可能存在特殊的耐受高濃度Na+和Cl-的機(jī)制，有利于它們更好的適應(yīng)高鹽度環(huán)境。
　　 非泌鹽紅樹(shù)與泌鹽紅樹(shù)在滲透調(diào)節(jié)機(jī)制上還存在相同之處，即無(wú)機(jī)離子是四種紅樹(shù)植物應(yīng)對(duì)鹽生生境的最重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，Na+和Cl-在其中占了最大比例，貢獻(xiàn)了超過(guò)一半的滲透勢(shì)；有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物

5、質(zhì)的作用較小，并隨著NaCl處理濃度的提高和時(shí)間延續(xù)而逐漸減低。K+對(duì)四種紅樹(shù)植物的滲透調(diào)節(jié)作用在鹽處理下都被減弱，Na+/K+比值在實(shí)驗(yàn)后期都大于2，但是，K+在四種紅樹(shù)植物中都保持了較高的含量，在各種處理?xiàng)l件下都高于100 mM，這可能是紅樹(shù)植物有效的耐鹽機(jī)制之一；可溶性糖和K+都是四種紅樹(shù)植物中無(wú)鹽處理時(shí)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，但它們的滲透調(diào)節(jié)貢獻(xiàn)率受鹽處理而降低，在無(wú)鹽處理下的貢獻(xiàn)作用更大；脯氨酸的含量受鹽處理都提高，但滲透貢獻(xiàn)率不

6、足0.2％，對(duì)滲透調(diào)節(jié)的貢獻(xiàn)作用不大。
　　 不同紅樹(shù)植物還具有不同的滲透調(diào)節(jié)特性。如總游離氨基酸的貢獻(xiàn)率在秋茄和白骨壤中受鹽處理提高，在木欖和桐花樹(shù)中則受鹽處理而降低。從整個(gè)細(xì)胞水平看，甘氨酸甜菜堿(GB)對(duì)滲透調(diào)節(jié)的作用不太大，但是考慮到它在胞質(zhì)中的特異分布，GB可能對(duì)白骨壤葉片細(xì)胞質(zhì)的滲透調(diào)節(jié)有非常重要的作用。從秋茄葉片中的松醇和甘露醇以及桐花樹(shù)葉片中的有機(jī)酸對(duì)總滲透勢(shì)的貢獻(xiàn)率來(lái)看，多元醇和有機(jī)酸在紅樹(shù)植物中的滲透調(diào)節(jié)作用

7、也十分有限。
　　 2.通過(guò)雙向電泳分離及質(zhì)譜分析鑒定，對(duì)0mM、200mM和500mM三種不同濃度NaCl處理45d后紅樹(shù)植物(秋茄、桐花樹(shù)和木欖)葉片的差異蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了研究，這是首次對(duì)秋茄和桐花樹(shù)蛋白質(zhì)組研究的報(bào)道。結(jié)果表明，不同濃度NaCl處理導(dǎo)致三種紅樹(shù)植物的2-DE凝膠表達(dá)圖譜發(fā)生了變化，其中秋茄葉片中有22個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)量改變，桐花樹(shù)和木欖葉片中分別有21個(gè)和22個(gè)蛋白表達(dá)量發(fā)生變化。經(jīng)MALDI-TOF/MS分析

8、鑒定，秋茄葉片HSC70和HSP60在高鹽脅迫下表達(dá)量發(fā)生改變，表明熱激蛋白(Heat shock proteins，HSPs)在秋茄適應(yīng)鹽生環(huán)境的過(guò)程中起了作用。經(jīng)MALDI-TOF/MS分析鑒定，桐花樹(shù)葉片核糖體失活蛋白(Ribosome inactivating protein，RIP)在鹽處理下被誘導(dǎo)表達(dá)，SNARE蛋白可能通過(guò)在鹽處理下降低表達(dá)而減少ROS對(duì)液泡的傷害，從而提高桐花樹(shù)的抗鹽性。
　　 LC-MS/MS對(duì)

9、木欖葉片差異表達(dá)的10個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行了成功的鑒定，結(jié)果表明，chCpn60、Rubisco活化酶(Rubisco activase，RCA)、HSP、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(Glutathione transferase，GST)、短鏈脫氫/還原酶(Short-chaindehydrogenase/reductase，SDR)、肌動(dòng)蛋白和一個(gè)未知蛋白等協(xié)同作用參與木欖的鹽脅迫響應(yīng)，未知蛋白的發(fā)現(xiàn)有利于揭示紅樹(shù)植物新的耐鹽機(jī)制。木欖在兩種不同濃度N

10、aCl處理下調(diào)控機(jī)制有所不同，在高鹽和中等鹽度處理下木欖分別通過(guò)chCpn6和RCA的作用間接保護(hù)光合作用。此外，木欖在高鹽脅迫下積累肌動(dòng)蛋白以保護(hù)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)；中等鹽度處理下木欖提高GST以清除體內(nèi)多余活性氧，起到抗氧化作用；SDR表達(dá)量在中等鹽度處理下降低，可能減少通過(guò)ABA介導(dǎo)的對(duì)滲透脅迫響應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，表明在適宜鹽度下生長(zhǎng)的木欖可減少對(duì)體內(nèi)生理功能的調(diào)控，更好的保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。
　　 3.研究了模式植物擬南芥Na+/H

11、+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtNHX2、AtNHX3、AtNHX5和AtNHX6的亞細(xì)胞定位情況，以便為研究紅樹(shù)植物的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提供更好的理論基礎(chǔ)。運(yùn)用Gateway技術(shù)構(gòu)建了以CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的融合GFP(或YFP)的植物表達(dá)載體，通過(guò)基因槍轟擊使之在洋蔥表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，也通過(guò)花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥穩(wěn)定表達(dá)，再利用熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光蛋白的表達(dá)情況，本實(shí)驗(yàn)首次報(bào)道了對(duì)AtNHX3、AtNHX5和AtNHX6

12、的亞細(xì)胞定位研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在洋蔥表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)AtNHX2-YFP和AtNHX3-YFP發(fā)現(xiàn)，AtNHX2和AtNHX3主要定位于液泡膜；對(duì)洋蔥表皮細(xì)胞和擬南芥植株中表達(dá)AtNHX5-YFP的觀察發(fā)現(xiàn)，AtNHX5沒(méi)有定位于質(zhì)膜或液泡膜，可能在內(nèi)涵體/液泡前體等內(nèi)膜系統(tǒng)上。AtNHX5在洋蔥細(xì)胞和擬南芥細(xì)胞中運(yùn)動(dòng)或沿類似TVS(Transvacuolar cytoplasmic strand，TVS)的結(jié)構(gòu)運(yùn)動(dòng)，表明AtNHX