海南粗榧內(nèi)生真菌CH1307的初步鑒定與高三尖杉酯堿發(fā)酵條件研究.pdf

1、從藥用植物內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物中尋找各類生物活性物質(zhì)是當前研究的熱點。海南粗榧(Cephalotaxus mannii Hook.f.)因其根、莖、葉和果實中均含有抗癌成分三尖杉酯堿類化合物而備受關(guān)注,但由于過度采伐、生存環(huán)境不斷惡化,加之其種群遺傳多樣性水平低,造成這種植物幾近滅絕,資源極其匱乏。
　　 為尋找替代從海南粗榧植物中提取三尖杉酯堿類化合物的方法,本課題組致力于從該植物的內(nèi)生菌中尋找新途徑。本文在課題前期基礎(chǔ)上,對分離

2、自海南粗榧莖干韌皮部的一株內(nèi)生真菌CH1307進行了初步鑒定,并通過發(fā)酵條件優(yōu)化、補料分批發(fā)酵等,使產(chǎn)物中高三尖杉酯堿含量得到有效提高。
　　 菌株CH1307在PDA平板上培養(yǎng)初期菌落直徑5-10mm,近圓形,邊緣較整齊,正面白色,背面為黃褐色,不透明,菌落表面呈致密絨毛狀,氣生菌絲高度約1.2mm;培養(yǎng)后期菌落顏色漸深,呈黑褐色,菌落變?yōu)槊珰譅?直徑達30-50mm。該菌在液體培養(yǎng)基中生長量較大,菌絲球大小基本均一,培養(yǎng)液澄

3、清,培養(yǎng)初期(1-4d)菌體呈白色,培養(yǎng)后期(5-7d)菌體開始產(chǎn)色素,呈棕褐色。顯微鏡下觀察菌絲體透明,表面光滑,分枝分隔,培養(yǎng)初期菌絲頂端生長,呈細長狀,分枝不甚發(fā)達,在一般培養(yǎng)條件下觀察不到無性或有性孢子和繁殖體,以不同條件進行誘孢培養(yǎng)、并重復(fù)多次也未觀察到孢子。較為特殊的是顯微鏡下其菌絲細胞的內(nèi)含物在3thd即見呈大量圓球形顆粒狀,菌絲斷裂時顆粒物即隨之釋放出來。Biolog系統(tǒng)生化鑒定結(jié)果顯示:該菌株與Scopulariops

4、isbrumptii的相似值最大,但也僅為0.172,遠低于0.5,難以作出推斷。18S rDNA序列測定長度830bp,BLAST同源性比較結(jié)果顯示:該菌株與Pleosporales sp.,Paraconiothyriumsp.,Coniothyrium sp.等21個菌株的18S rDNA序列同源性均為97％。ITS測序比對結(jié)果顯示:其與一株未可培養(yǎng)土壤真菌(gd|DQ420823.1|)一致性也僅為84％。初步推測該菌株有可能是

5、一個新屬或新種,進一步的鑒定工作仍在進行中。
　　 通過測定該菌株的生長曲線和代謝產(chǎn)物的合成規(guī)律,發(fā)現(xiàn)該菌株在發(fā)酵的5thd即可檢測到有高三尖杉酯堿的生成。分別在發(fā)酵的4thd、7thd補料培養(yǎng),既利于細胞的快速生長,也有利于高三尖杉酯堿的生成。在穩(wěn)定期添加利于高三尖杉酯堿合成的前體物質(zhì)酪氨酸和苯丙氨酸,使高三尖杉酯堿產(chǎn)量顯著提高。在碳源種類、碳源添加量、接種量、裝液量等單因素試驗之后,以搖床轉(zhuǎn)速、牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨、酪氨酸

6、、苯丙氨酸六個因素為自變量,發(fā)酵液及細胞內(nèi)高三尖杉酯堿總產(chǎn)量為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面分析試驗,對發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,建立了回歸方程。結(jié)果表明搖床轉(zhuǎn)速、酪氨酸、苯丙氨酸對高三尖杉酯堿產(chǎn)量有極顯著影響;硝酸銨對高三尖杉酯堿產(chǎn)量有顯著影響;牛肉膏、酪氨酸的交互作用對高三尖杉酯堿產(chǎn)量有顯著影響,其他各項均未達到顯著水平。
　　 最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為:在PDB基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加蔗糖25g/L,牛肉膏1g/L,蛋白胨1.134 g/L,硝酸銨1.5