供體氣管上皮細(xì)胞的凋亡促進(jìn)阻塞性細(xì)支氣管炎的發(fā)生及機(jī)制研究.pdf

1、肺移植是治療多種終末期肺部疾病的有效方法，但肺移植患者術(shù)后的生存情況不佳，移植術(shù)后患者的生存率遠(yuǎn)低于心、肝、腎等其他實(shí)體器官移植。接受肺移植的成年患者五年生存率只有53％。肺移植后病人長(zhǎng)時(shí)間存活的主要障礙是阻塞性細(xì)支氣管炎綜合征(bronchiolitis obliterans syndrome, BOS)。BOS的組織學(xué)標(biāo)志是阻塞性細(xì)支氣管炎(obliterative bronchiolitis, OB)。OB是一個(gè)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維

2、化的過(guò)程，其特征是粘膜下的纖維化導(dǎo)致的部分或完全的氣道阻塞。阻塞性細(xì)支氣管炎(obliterative bronchiolitis, OB)是導(dǎo)致存活時(shí)間大于1年的肺移植患者死亡的主要原因。大約有50%的成年肺移植患者在術(shù)后5年內(nèi)會(huì)出現(xiàn)BOS。一旦確診BOS，那么病人的中位生存時(shí)間大約只有2.5年。雖然目前肺保存技術(shù)、外科手術(shù)技術(shù)和免疫抑制治療有了很大提高，但OB的治療效果仍然欠佳。肺移植后OB的發(fā)生危害了患者的肺功能，降低了其生活質(zhì)量

3、，所以進(jìn)一步探明OB的發(fā)病機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上尋找有效的治療方法，可以改善肺移植患者的預(yù)后，并能推動(dòng)肺移植手術(shù)的推廣。
　　OB的病理生理機(jī)制復(fù)雜，這也是肺移植患者預(yù)后欠佳的重要原因。眾所周知，氣管上皮細(xì)胞是肺移植后異種免疫的主要攻擊靶點(diǎn)，而且上皮細(xì)胞的損傷引起了一系列的反應(yīng)，最終導(dǎo)致OB的發(fā)生，上皮細(xì)胞的損傷是OB發(fā)生發(fā)展的始發(fā)因素。有研究表明上皮細(xì)胞的凋亡與OB的發(fā)生有關(guān)。Hansen等發(fā)現(xiàn)患有OB的肺移植病人的氣管組織中凋亡上

4、皮細(xì)胞的數(shù)量比對(duì)照組多，而且凋亡上皮細(xì)胞的數(shù)量與肺移植患者發(fā)生OB的易感性呈正相關(guān)。
　　OB的病理特征顯示上皮細(xì)胞和上皮下結(jié)構(gòu)的損傷和炎癥導(dǎo)致了過(guò)量的纖維性增生。在OB的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中大量的細(xì)胞外基質(zhì)沉積于氣管腔，并且肌成纖維細(xì)胞是OB過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生的主要細(xì)胞，其數(shù)量在OB時(shí)出現(xiàn)了增加。外周血中來(lái)源于骨髓的纖維細(xì)胞是一種特殊形式的間充質(zhì)干細(xì)胞。這些纖維細(xì)胞是肌成纖維細(xì)胞的來(lái)源之一。它們?cè)谶w移到目標(biāo)區(qū)域后能夠分化為肌成纖維細(xì)

5、胞。然而，氣管上皮細(xì)胞的凋亡與移植物中肌成纖維細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系卻仍有爭(zhēng)論。我們通過(guò)建立性別錯(cuò)配的骨髓移植模型，獲得了骨髓組織表達(dá)Y染色體的嵌合體小鼠，從而能夠標(biāo)記骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。以嵌合體小鼠為受體，行原位氣管移植，探討氣管上皮細(xì)胞凋亡對(duì)受體骨髓組織中間充質(zhì)干細(xì)胞的作用、氣管上皮細(xì)胞凋亡與移植物中骨髓來(lái)源的肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量之間的關(guān)系以及可能的機(jī)制。
　　本研究包括以下兩部分：第一部分：嵌合體小鼠的構(gòu)建；第二部分：供體氣管上皮

6、細(xì)胞凋亡促進(jìn)阻塞性細(xì)支氣管炎的發(fā)生及相關(guān)機(jī)制。
　　第一部分：嵌合體小鼠的構(gòu)建
　　背景：要研究骨髓來(lái)源的細(xì)胞在阻塞性細(xì)支氣管炎（obliterative bronchiolitis, OB）形成過(guò)程中的遷移情況，首先需要對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。Y染色體標(biāo)記法是通過(guò)骨髓移植將雄性動(dòng)物的細(xì)胞移植到雌性動(dòng)物體內(nèi)，獲得性別錯(cuò)配的嵌合體動(dòng)物，以雄性動(dòng)物特異性的Y染色體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，這種方法實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，并且標(biāo)記的效果確切。在移植骨髓細(xì)

7、胞前需要對(duì)受體動(dòng)物進(jìn)行清髓性致死性的全身照射。而致死性的照射不僅破壞了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的骨髓微環(huán)境，而且使受體動(dòng)物發(fā)生了放射性損傷。間充質(zhì)干細(xì)胞能夠協(xié)同促進(jìn)造血干細(xì)胞移植。間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分化成造血微環(huán)境的不同細(xì)胞成分，從而促進(jìn)了造血功能的恢復(fù)。我們的研究試圖探明將骨髓細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共移植能否減輕放射性損傷加快造血功能的恢復(fù)。
　　方法：首先分離雄性C57BL/6小鼠的骨髓細(xì)胞，在體外條件下培養(yǎng)得到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。雌性 C57B

8、L/6小鼠接受致死量全身照射（8Gy）后，經(jīng)尾靜脈給不同分組的小鼠注射不同的細(xì)胞成分。對(duì)照組小鼠注射0.2 ml PBS；骨髓細(xì)胞組小鼠注射0.2 ml含1×107骨髓細(xì)胞的PBS；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組小鼠注射0.2 ml含1×106骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的PBS；骨髓細(xì)胞+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組小鼠注射0.2 ml含1×107骨髓細(xì)胞和1×106骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的PBS。在移植后的第1、2、4周分別取受體小鼠的外周血，提取基因組DNA后行熒光定量

9、PCR檢測(cè)Y染色體特異性基因SRY，計(jì)算受體小鼠外周血單核細(xì)胞中的雄性細(xì)胞的比例（嵌合率），比較不同小組的嵌合率水平。
　　結(jié)果：所有對(duì)照組小鼠在移植后的2.5周內(nèi)死亡，在移植后第1和第2周無(wú)SRY基因的表達(dá)。骨髓細(xì)胞組小鼠的嵌合率逐漸增長(zhǎng)并最終達(dá)到90%以上。單純間充質(zhì)干細(xì)胞組小鼠有2只死亡，該組小鼠的嵌合率雖然有所增加，但一直處于較低水平。骨髓細(xì)胞+間充質(zhì)干細(xì)胞組小鼠的嵌合率逐漸增加，并達(dá)到了90%以上，并且嵌合率的增加速度和

10、放射相關(guān)并發(fā)癥的恢復(fù)速度比骨髓細(xì)胞組小鼠更快。
　　結(jié)論：通過(guò)本部分實(shí)驗(yàn)我們建立了改良的骨髓移植模型，在骨髓移植時(shí)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓細(xì)胞共移植時(shí)，受體小鼠的造血功能恢復(fù)更快，且放射相關(guān)并發(fā)癥的恢復(fù)也更快。從而能更好地獲得骨髓細(xì)胞含有Y染色體的嵌合體小鼠，為進(jìn)一步研究骨髓來(lái)源的細(xì)胞在氣管移植后的遷移和作用奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分：供體氣管上皮細(xì)胞凋亡促進(jìn)阻塞性細(xì)支氣管炎的發(fā)生及相關(guān)機(jī)制
　　背景：肺移植是多種終末

11、期肺疾病的唯一有效的治療手段，但肺移植病人的遠(yuǎn)期生存情況卻不令人滿(mǎn)意，成人肺移植患者的五年生存率只有53%。造成這種情況的主要原因是阻塞性細(xì)支氣管炎的發(fā)生。對(duì)生存時(shí)間大于1年的肺移植患者而言，其最常見(jiàn)的死亡原因就是阻塞性細(xì)支氣管炎。臨床上，我們稱(chēng)阻塞性細(xì)支氣管炎為阻塞性細(xì)支氣管炎綜合征（bronchiolitis obliterans syndrome, BOS）。在首次接受肺移植的受體中術(shù)后5年內(nèi)有大約50%的受體罹患了BOS。然而，

12、目前針對(duì)阻塞性細(xì)支氣管炎的治療措施卻不能有效的預(yù)防其發(fā)生和發(fā)展。氣管上皮細(xì)胞凋亡通過(guò)一系列反應(yīng)啟動(dòng)了阻塞性細(xì)支氣管炎的發(fā)生。我們的研究試圖探討供體氣管上皮細(xì)胞的凋亡能否促進(jìn)受體骨髓來(lái)源的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，進(jìn)而參與OB的發(fā)生發(fā)展及相關(guān)機(jī)制。
　　方法：建立小鼠原位氣管移植模型，分別以雌性C57BL/6和BALB/c小鼠為供體，嵌合體小鼠為受體進(jìn)行氣管移植。在移植后的第1，2，3，4周取移植氣管，對(duì)氣管組織行石蠟包埋后切片，對(duì)切

13、片行 HE染色后分析氣管腔阻塞情況。對(duì)切片行免疫熒光雙標(biāo)染色分析上皮細(xì)胞凋亡情況及骨髓來(lái)源的肌成纖維細(xì)胞。以免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)移植物中SDF-1α和TGF-β的表達(dá)，以及CD4+和CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。
　　結(jié)果：在氣管移植模型中，與對(duì)照組相比，同種異體移植物中凋亡的氣管上皮細(xì)胞更多，且在不同的時(shí)間點(diǎn)同種異體移植物的氣管腔阻塞率更高。氣管上皮細(xì)胞凋亡發(fā)生的時(shí)間比氣管腔阻塞發(fā)生的時(shí)間更早。在氣管移植后的第2到第4周同種異體移植

14、物中骨髓來(lái)源的肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量也比對(duì)照組多。同種異體移植物中SDF-1α和TGF-β的含量也比對(duì)照組高。在氣管移植后的第1周 CD4+T細(xì)胞數(shù)量最多，之后稍有減少，移植后第1到4周CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)在同種異體移植物中逐漸增多，而在對(duì)照組中其浸潤(rùn)較為輕微且未隨時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)增多。
　　結(jié)論：我們的實(shí)驗(yàn)表明OB的發(fā)生過(guò)程中凋亡的氣管上皮細(xì)胞可能增加了骨髓來(lái)源的肌成纖維細(xì)胞。骨髓來(lái)源的細(xì)胞可能在SDF-1α的作用下遷移到移植物中，在T