基于LC-MS代謝組學(xué)技術(shù)的肺癌細(xì)胞氨基酸代謝足跡分析方法建立及應(yīng)用.pdf

1、代謝組學(xué)主要考察生物體系受擾動(dòng)（環(huán)境因素、遺傳因素等）條件下的代謝物種類(lèi)及數(shù)量上的變化情況，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。從研究?jī)?nèi)容而言，代謝組學(xué)可分為代謝指紋分析和代謝足跡分析，其中代謝足跡分析（Metabolic footprinting analysis）考察生物體細(xì)胞外介質(zhì)代謝組特征，通過(guò)分析組織細(xì)胞對(duì)環(huán)境/培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物的消耗以及代謝物分泌情況，可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)無(wú)損監(jiān)控其代謝特征，對(duì)生物標(biāo)志物（Biomarker）的發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)具有重要

2、意義。
　　本研究建立了基于LC-MS代謝組學(xué)技術(shù)的細(xì)胞氨基酸代謝足跡分析方法，并以肺癌和支氣管上皮細(xì)胞為生物模型，獲得其氨基酸代謝輪廓特征差異。研究首先基于高分辨質(zhì)譜技術(shù)對(duì)肺癌細(xì)胞和非腫瘤對(duì)照細(xì)胞——支氣管上皮細(xì)胞的細(xì)胞外液進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，通過(guò)檢測(cè)樣本中的小分子代謝物(相對(duì)分子量≤1000Da)，結(jié)合主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法（OPLS-DA）和分層聚類(lèi)分析（HCA）等化學(xué)計(jì)量學(xué)及模式識(shí)別手段，采用多標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)

3、（VIP排序、Pearson相關(guān)常數(shù)及Jack-Knife置信區(qū)間等參數(shù)）對(duì)差異代謝物進(jìn)行鑒定和解釋?zhuān)Y(jié)果提示肺癌細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞的脂代謝和氨基酸/多肽代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出明顯差異。基于課題組分子細(xì)胞生物學(xué)前期研究結(jié)果并結(jié)合腫瘤氨基酸代謝相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研，我們采用靶向代謝組學(xué)手段對(duì)肺癌細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞的細(xì)胞外液進(jìn)行了氨基酸代謝足跡分析。為避免基質(zhì)中待測(cè)物干擾，實(shí)驗(yàn)有針對(duì)性地開(kāi)發(fā)并建立了氨基酸替代分析物法，將待測(cè)氨基酸對(duì)應(yīng)的穩(wěn)定性同位素作為替代分

4、析物加入到正常的生物基質(zhì)中建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而更加準(zhǔn)確地定量檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的多種氨基酸；此外，方法采用親水作用色譜（HILIC），避免采用傳統(tǒng)氨基酸檢測(cè)方法中所需的衍生化試劑和離子對(duì)試劑，大大簡(jiǎn)化了樣品前處理步驟，縮短了分析時(shí)間并提高了檢測(cè)靈敏度。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明此方法表現(xiàn)出較好的準(zhǔn)確度（91.54％≤RE≤114.31%）、重復(fù)性（0.87%≤RSD≤14.48%）和較高的回收率（Recovery≥75.35%）。應(yīng)用該方法對(duì)肺癌細(xì)