Phanerochaete chrysosporium厚垣孢子的產(chǎn)生條件及其分化機(jī)制研究.pdf

1、黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）是一株典型的白腐真菌，該菌株不僅具有非特異性的降解能力，而且能夠產(chǎn)生具有抗逆性的厚垣孢子。真菌一旦形成了厚垣孢子，就可以有較長的貨架期。本文描述了一種P.chrysosporium厚垣孢子工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵工藝。同時(shí)，探究其形成機(jī)制，以期指導(dǎo)生產(chǎn)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴介紹采用發(fā)酵工藝中補(bǔ)料分批培養(yǎng)形式，通過對厚垣孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基（補(bǔ)料）營養(yǎng)成分和發(fā)酵條件的

2、單因素實(shí)驗(yàn)，得到了適用于工業(yè)發(fā)酵P.chrysosporium產(chǎn)厚垣孢子的生產(chǎn)工藝。優(yōu)化后的補(bǔ)料配方是誘導(dǎo)劑-a3.8 g/L，七水合硫酸鎂2.5 g/L，硫酸氨含量為3.0 g/L，葡萄糖含量為30.0 g/L、苯甲醇0.50 mL/L、磷酸二氫鉀2.0 g/L、氯化鈣0.50g/L、吐溫800.50 mL/L、維生素B10.001 g/L、微量元素液70.0 mL/L。最佳培養(yǎng)條件是:將100 mL、pH4.5的四倍濃縮補(bǔ)料接入已培

3、養(yǎng)48 h菌絲的培養(yǎng)基中，在35℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3d，菌絲球干重及孢子數(shù)量分別是3.97 g/L、2.687×109個(gè)/L。⑵將上述優(yōu)化的條件，應(yīng)用于50 L發(fā)酵罐，最優(yōu)的生產(chǎn)條件是將菌絲培養(yǎng)36h后補(bǔ)料，補(bǔ)料后60 h放罐，收獲厚垣孢子。與搖瓶相比，整個(gè)發(fā)酵周期縮短了24 h，厚垣孢子數(shù)量為5.710×109個(gè)/L，最終得到300.0 g產(chǎn)品，還原糖僅剩0.18 g/L。利用濕室載片培養(yǎng)技術(shù)測產(chǎn)品的萌發(fā)率為72％。

4、⑶通過對固體培養(yǎng)基及接種時(shí)菌的狀態(tài)的篩選比較，采用等比例秸稈麥麩培養(yǎng)基，接種1.0 g菌絲球發(fā)酵一周可產(chǎn)生大量厚壁的大孢子細(xì)胞，形成的菌墊約厚2.5 mm，與空氣接觸面較光滑且形成少量分生孢子，余1.336 g秸稈麩皮，利用率達(dá)86.64％。該大孢子細(xì)胞的特征是細(xì)胞壁普遍較液體發(fā)酵的厚垣孢子厚，且直徑較大，測得的最大直徑約70μm，在直徑為40μm的大孢子中，細(xì)胞壁厚約6.7μm。⑷應(yīng)用熒光染色技術(shù)測厚垣孢子成分。細(xì)胞壁由薄外壁及厚內(nèi)壁

5、組成，增厚部分由含β-1，4-糖苷鍵的多糖組成。細(xì)胞內(nèi)含大量的中性脂肪酸。在纖維素酶解實(shí)驗(yàn)中，20 mg等量的菌絲和厚垣孢子細(xì)胞壁經(jīng)酶解，測得的終產(chǎn)物濃度分別為0.244g/L和0.215g/L，即纖維素不是厚垣孢子增厚細(xì)胞壁的主要成分;在β-葡聚糖酶解實(shí)驗(yàn)中，20 mg等量的菌絲和厚垣孢子細(xì)胞壁經(jīng)酶解，測得的終產(chǎn)物濃度分別為0.480g/L和0.598g/L，即厚垣孢子葡聚糖含量較高;在幾丁質(zhì)酶解實(shí)驗(yàn)中，5 mg等量的菌絲和厚垣孢子細(xì)

6、胞壁經(jīng)酶解，測得的終產(chǎn)物濃度分別為0.313 g/L和0.290 g/L，即兩者含量無明顯差異。⑸鎖定三條主要的顯著富集的代謝通路-淀粉和蔗糖代謝通路、MAPK代謝通路及脂肪酸降解通路，并推導(dǎo)出P.chrysosporium的葡聚糖合成路徑、脂肪酸代謝路徑及MAPK調(diào)控路徑，推測厚垣孢子增厚的細(xì)胞壁成分可能與葡聚糖有關(guān)，細(xì)胞內(nèi)合成同時(shí)積累脂肪酸，為維持正常生長提供能量。選取六個(gè)相關(guān)的基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，從整體上看此次轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)