基于FRET原理構(gòu)建金納米猝滅的熒光探針實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中葡萄糖的檢測.pdf

1、半導(dǎo)體納米粒子或量子點(diǎn)具有獨(dú)特的光物理學(xué)特點(diǎn)，比如量子點(diǎn)的發(fā)射波長可通過控制它的大小和組成來調(diào)諧，高的熒光量子產(chǎn)率，抗光漂白能力強(qiáng)等。正是由于這些優(yōu)點(diǎn)，量子點(diǎn)被廣泛的應(yīng)用于生物傳感中的熒光標(biāo)記。將生物材料修飾在納米顆粒的表面上就可以合成新型的多功能納米生物復(fù)合物。納米熒光探針作為一種新型的探針，它所特有的量子尺寸效應(yīng)和小的顆粒尺寸使之呈現(xiàn)出許多與同質(zhì)單個(gè)分子或大塊物體不同的光學(xué)性質(zhì)，已經(jīng)被成功應(yīng)用于生物樣品檢測及活體細(xì)胞成像中。最近，由

2、蛋白質(zhì)修飾的納米顆粒組裝的生物納米傳感器已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注，例如，半導(dǎo)體量子點(diǎn)已經(jīng)被作為一種極好的材料用于酶反應(yīng)的生物分析和應(yīng)用當(dāng)中。因此，設(shè)計(jì)具有良好性能的新型熒光納米生物傳感器用來實(shí)現(xiàn)生物活性分子或細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)的分析和檢測已經(jīng)成為科學(xué)工作者的巨大挑戰(zhàn)。
　　熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)作為重要的光物理技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物大分子之間距離的定性、定量檢測。熒光共振能量轉(zhuǎn)移的效率決定于供體受體之間的距離及其光譜重疊程度。其中，能

3、量給予者為供體(donor)，熒光素量子產(chǎn)率高，是最常用的供體分子。能量接受者為受體(acceptor)，受體可發(fā)射自己的特征熒光(熒光增強(qiáng))，也可作為猝滅劑不發(fā)熒光(熒光猝滅)，不產(chǎn)生熒光的受體其優(yōu)勢在于能夠減少可能由受體本身直接產(chǎn)生的熒光背景的干擾。
　　作為一種熒光猝滅劑，金納米顆?？梢杂械剽鐭晒鈭F(tuán)的熒光。納米金具有比較寬的猝滅范圍、對熒光試劑高的猝滅效率以及良好的穩(wěn)定性，可以提高FRET過程的靈敏度和特異性，使其成為一個(gè)

4、研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)的有機(jī)猝滅劑相比，金納米粒子具有特殊的結(jié)構(gòu)特征和光學(xué)性質(zhì)，低的毒性以及好的生物相容性，所以金納米作為一種極好的猝滅劑已經(jīng)開拓了高靈敏度檢測生物活性分子的前景葡萄糖是一種重要的生物活性物質(zhì)，對細(xì)胞的健康生長起著非常重要的作用。葡萄糖的缺乏或過量都會(huì)對體內(nèi)的新陳代謝產(chǎn)生不利的影響。目前有很多報(bào)道發(fā)現(xiàn)相對于正常細(xì)胞來說癌變細(xì)胞的代謝要消耗更多的葡萄糖。這其中的原因到目前為止還不是很清楚，但是癌細(xì)胞的糖代謝旺盛這一點(diǎn)是大

5、家普遍認(rèn)同的。目前，已經(jīng)報(bào)道許多種有關(guān)葡萄糖含量的檢測方法。其中，基于右旋糖酐、葡萄糖與葡萄糖氧化酶的競爭性結(jié)合的熒光檢測方法由于其具有良好的選擇性和較低的損傷度已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于葡萄糖的檢測當(dāng)中。但是這些方法的檢測限一般不高，而且毒性問題依然存在，限制了生物樣品葡萄糖含量的直接檢測，從而限制了細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)換及細(xì)胞成像等方面的應(yīng)用，所以設(shè)計(jì)一種穩(wěn)定的高選擇性的納米熒光探針用于活細(xì)胞中葡萄糖的成像是非常有意義的。本文主要開展了以下兩部分的研

6、究工作:
　　(一)基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理(FRET)設(shè)計(jì)了一種簡單的有效的熒光納米探針用于葡萄糖的檢測。探針的思路源于葡萄糖與 apo-葡萄糖氧化酶(apo-GOx)是特異性結(jié)合的，其結(jié)合力大于右旋糖酐(Dextran)與 apo-GOx的結(jié)合力。探針選擇apo-GOx-Dextran作為發(fā)生 FRET的載體，F(xiàn)ITC-Dextran作為能量供體，apo-GOx修飾的金納米顆粒(AuNPs)作為能量的受體。在體系中不存在葡萄糖

7、的時(shí)候，由于apo-GOx與 Dextran之間具有結(jié)合力，使得 Dextran-FITC與 AuNPs-apo-GOx相互靠近，滿足能量共振轉(zhuǎn)移的條件，在FITC的激發(fā)波長下激發(fā)時(shí)，F(xiàn)ITC發(fā)射的熒光被金納米粒子吸收，顯示為熒光猝滅。當(dāng)加入葡萄糖時(shí)，葡萄糖會(huì)與 Dextran競爭與 apo-GOx結(jié)合，使得FITC-Dextran與 AuNPs-apo-GOx遠(yuǎn)離，能量轉(zhuǎn)移消失，F(xiàn)ITC的熒光信號(hào)恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，

8、熒光光譜分析表明熒光強(qiáng)度隨葡萄糖濃度的逐步增大而成線性增強(qiáng)，線性范圍為20 nM-0.2μM。同時(shí)，該探針具有高的靈敏度和選擇性，檢測限為5 nM。細(xì)胞中存在的其它糖類和大多數(shù)生物物種不會(huì)對它的測定產(chǎn)生影響，該納米探針成功應(yīng)用于活細(xì)胞中葡萄糖的成像。
　　(二)基于兩種不同尺度的金納米構(gòu)建的熒光探針實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中葡萄糖的檢測。2 nm的巰基十一酸修飾的金納米(LAuND)修飾上 apo-GOx作為供體，10 nm的Dextran修飾