棗葉中黃酮類化合物分析及清除自由基活性研究.pdf

1、棗（Ziziphus Jujuba Mill.）和酸棗(Ziziphusjujuba Mill.var.spinosa(Bunge) Hu exH.F.Chow)為鼠李科(Rhamnaceae)棗屬植物，原產(chǎn)于我國，是我國最古老的果樹之一，其栽培利用已有數(shù)千年歷史。棗葉為棗屬植物的葉子，據(jù)《日華子本草》記載，棗葉性味“溫，無毒”。而據(jù)《本草綱目》記載，酸棗葉可“斂瘡解毒，治脛臁瘡”，在民間以棗葉為茶飲用的習(xí)慣十分廣泛，然而對于棗葉中的化

2、學(xué)成分，以往未見較系統(tǒng)的研究。本文以棗葉為材料，對嫩葉、老葉的化學(xué)成分進行分析，共分離鑒定出9種主要的黃酮成分;再以此為對照品，分別建立了同時檢測嫩葉中8種黃酮、老葉中5種黃酮的高效液相色譜(HPLC)分析方法，并以此方法分析了14個不同品種棗葉中各黃酮的含量;比較了棗葉不同極性萃取物及各單體黃酮成分清除自由基的活性，為棗葉資源的綜合開發(fā)利用及棗葉茶的質(zhì)量控制提供科學(xué)根據(jù)。
　　1.以乙醇-水為溶劑對棗葉中的有效成分進行提取，經(jīng)不

3、同極性的有機溶劑萃取，再以甲醇-水或乙腈-水為流動相經(jīng)制備HPLC純化，從棗葉嫩葉和老葉中共得到9種主要成分，采用峰面積百分比法檢測各化合物純度均在96％以上，經(jīng)LC-MS和1H-NMR、13C-NMR法對其進行結(jié)構(gòu)鑒定，9種化合物分別為:槲皮素-3-O-洋槐糖苷(1)、蘆丁(2)、山奈酚-3-O-蕓香糖苷(3)、槲皮素-3-O-鼠李糖苷(4)、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷(5)、槲皮素鼠李糖-對羥基桂

4、皮酰葡萄糖(6)、3'，5'-間-C-β-D-吡喃葡萄糖基-4-O-對香豆?；に?7)、3'，5'-間-C-β-D-吡喃葡萄糖基根皮素(8)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(9)。
　　2.以純化的9種黃酮類成分為對照品，分別建立了可用于棗葉嫩葉中8種黃酮、老葉5種黃酮定量分析的梯度洗脫HPLC方法。嫩葉8種黃酮在42 min內(nèi)實現(xiàn)良好分離，色譜條件為:色譜柱Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5μ

5、m);流動相:A:1 mL/L甲酸水溶液;B:乙腈含1 mL/L的甲酸;梯度洗脫程序(min/B％):0/15，16/15,20/17，28/17，30/22，39/24，44/100，49/100，51/15，60/15;流速為1 mL/min;柱溫30℃;檢測波長300 nm。進樣量:10μL。用該方法對棗葉嫩葉進行分析，重復(fù)測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.46％～1.28％之間，最低檢出限為1.90～13.04 mg/mL之間，線性回歸方

6、程的相關(guān)系數(shù)r介于0.9997～0.9999之間，加標(biāo)回收率在94.76％～108.06％之間。老葉5種黃酮在30 min內(nèi)實現(xiàn)良好分離，色譜條件為:色譜柱HypersilBDS C18(4.6 mm×250 mm，5μm);流動相:A:1 mL/L甲酸水溶液;B:乙腈含1 mL/L的甲酸;梯度洗脫程序(min/B％):0/15，16/15，20/17，28/17，30/22，35/100，40/100,42/15，52/15;流速為1

7、 mL/min;柱溫30℃;DAD檢測波長360 nm。進樣量:10μL。用該方法對棗葉老葉進行分析，重復(fù)測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.59％～1.14％之間，最低檢出限為1.44～2.59 mg/mL之間，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)r介于0.9996～0.9999之間，加標(biāo)回收率在93.8％～105.9％之間。
　　3.采用建立的兩種HPLC方法對14個不同品種的棗葉嫩葉和老葉中的主要黃酮類成分進行測定。結(jié)果表明，棗葉中含有豐富的黃酮類成

8、分，嫩葉組成比老葉復(fù)雜，且含量遠高于老葉;不同品種之間各黃酮含量差異較大。在嫩葉中檢測到8種黃酮，其在14個品種嫩葉中平均含量為67.19±1.66 mg/g(D.W);而老葉中5種黃酮的平均含量僅為18.31±0.48 mg/g(D.W)。棗葉老葉和嫩葉共同含有4種黃酮，分別是槲皮素-3-O-洋槐糖苷、蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷;且各黃酮在嫩葉中的含量遠高于老葉。3'

9、，5'-間-C-β-D-吡喃葡萄糖基根皮素、槲皮素-3-O-鼠李糖、槲皮素鼠李糖-對羥基桂皮酰葡萄糖、3'，5'-間-C-β-D-吡喃葡萄糖基-4-O-對香豆?；に?種黃酮僅存在于嫩葉中;而槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷僅存在于老葉中。蘆丁、3'，5'-間-C-β-D-吡喃葡萄糖基根皮素、槲皮素-3-O-洋槐糖苷是嫩葉中主要的黃酮類化合物，這3種黃酮的含量占嫩葉8種黃酮總含量的81.4％。蘆丁和槲皮素-3-O-洋槐糖苷是老葉中主要

10、的黃酮，這2種黃酮的含量占老葉5種黃酮總含量的67.9％。
　　4.通過ABTS、DPPH實驗評價了棗葉提取物的清除自由基活性，結(jié)果表明，各提取物都具有一定的抗氧化能力，且活性與其質(zhì)量濃度間呈量效關(guān)系，但活性強弱順序各不相同，棗葉乙酸乙酯部位對DPPH·自由基的清除能力最強，而棗葉乙醇提取物對ABTS+·自由基的清除能力最強。棗葉總黃酮含量與清除DPPH·自由基活性之間呈現(xiàn)顯著相關(guān)性，而與清除ABTS+·自由基之間相關(guān)性較小。各單

11、體黃酮因其化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，其清除自由基活性有較大差別。同一濃度下9種黃酮類化合物清除DPPH·自由基的活性要遠強于其清除ABTS+·自由基的活性。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷兩種黃酮清除自由基活性較強;3'，5'-間-C-β-D-吡喃葡萄糖基根皮素、3'，5'-間-C-β-D-吡喃葡萄糖基-4-O-對香豆?；に厍宄鼶PPH·自由基活性很弱，但卻表現(xiàn)出較強的清除ABTS+·自由基活性;山奈酚-3-O-蕓香糖