原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞缺氧缺糖損傷模型的建立及損傷后calpain1表達(dá)變化規(guī)律的研究.pdf

1、目的：
　　 腦損傷是法醫(yī)學(xué)鑒定工作中常見的損傷類型，腦損傷發(fā)生后的繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞損傷的分子機(jī)制一直為各國學(xué)者所關(guān)注。以往關(guān)于腦損傷研究的模型存在腦損傷的力學(xué)特點(diǎn)不規(guī)則，同樣的力造成不同動(dòng)物腦損傷程度不一致及損傷影響范圍不易控制等問題。而原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞樣本較均勻，可以較好地控制損傷方法和損傷程度，損傷后觀察和檢測(cè)也比較方便，尤其在進(jìn)行某些損傷機(jī)制方面的研究有其明顯的優(yōu)越性，因此制作合適的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型對(duì)研究顱腦損傷的機(jī)制具

2、有重要意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)成功建立了原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞缺氧缺糖損傷模型，應(yīng)用倒置顯微鏡及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)觀察神經(jīng)細(xì)胞OGD損傷后的形態(tài)學(xué)變化，同時(shí)應(yīng)用western blot方法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞OGD損傷后calpainl及其底物map2在蛋白水平上表達(dá)隨時(shí)間變化的情況，研究calpainl在腦損傷后繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用，并對(duì)calpainl及map2表達(dá)變化的時(shí)間規(guī)律在推斷腦損傷形成時(shí)間方面的應(yīng)用進(jìn)行了探討。<

3、br>　　 實(shí)驗(yàn)材料與方法：
　　 選擇出生后1～2天的Wistar仔鼠，取大腦皮質(zhì)組織，剪碎，體積分?jǐn)?shù)為0.25％的胰酶消化，終止反應(yīng)，離心，沉淀細(xì)胞用含15％馬血清及1％B27的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮，過濾使之成為單細(xì)胞懸液，按2×106個(gè)/ml種植于預(yù)先包被多聚賴氨酸的六孔培養(yǎng)板中（免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色需預(yù)先在六孔板內(nèi)放置無菌蓋玻片），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2天后加終濃度101μmol/L 阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)

4、。神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)至第7天時(shí)，隨機(jī)分為1個(gè)對(duì)照組及4個(gè)損傷組，損傷組神經(jīng)細(xì)胞用含0.5mmol/L連二亞硫酸鈉的低糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行缺氧缺糖損傷30min，損傷后換原培養(yǎng)基分別繼續(xù)培養(yǎng)1h、6h、12h、24h。對(duì)照組只常規(guī)換液一次。對(duì)照組及損傷組神經(jīng)細(xì)胞分別進(jìn)行活細(xì)胞倒置顯微鏡觀察、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色和western blot檢測(cè)。
　　 結(jié) 果：
　　 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用連二亞硫酸鈉加低糖培養(yǎng)基成功制作了原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)

5、細(xì)胞缺氧缺糖損傷模型，通過活細(xì)胞倒置顯微鏡觀察和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞缺氧缺糖損傷后24h內(nèi)形態(tài)學(xué)發(fā)生了一系列改變。對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)較好，胞體豐滿，呈橢圓形或多極形，樹突、軸突較長(zhǎng)并相互交織。OGD損傷1h后，大部分神經(jīng)細(xì)胞仍保持原有形態(tài)，少數(shù)細(xì)胞突起縮短。傷后6h、12h，神經(jīng)細(xì)胞胞體明顯皺縮，多數(shù)細(xì)胞突起縮短，甚至消失。傷后24h，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)部分恢復(fù)，胞體變圓，部分突起重新出現(xiàn)。
　　 Western blot

6、結(jié)果顯示calpainl及其底物map2在大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中有表達(dá)。神經(jīng)細(xì)胞缺氧缺糖損傷后1h、6h、12h、24h，calpainl和map2蛋白表達(dá)強(qiáng)度改變有一定規(guī)律。與對(duì)照組相比，calpainl蛋白水平在OGD損傷后1h、6h、12h、24h表達(dá)均增強(qiáng)，其中傷后6h、12h組calpainl表達(dá)處于較高水平，傷后24h組calpainl表達(dá)高于1h組。與對(duì)照組相比，map2蛋白水平在OGD損傷后1h、6h、12h、24h表達(dá)均降