XIAP,SOD2和MMP-2在膀胱癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分XIAP RING結(jié)構(gòu)域通過(guò)介導(dǎo)miRNA-4295表達(dá)進(jìn)而抑制p63α的表達(dá)和促進(jìn)膀胱上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化
　　一、背景和目的:
　　X連鎖的細(xì)胞凋亡蛋白抑制因子(XIAP)是IAP家族的一員，是一種潛在的細(xì)胞凋亡抑制因子。據(jù)報(bào)道XIAP在急性、慢性白血病，前列腺癌和很多其他癌癥中均程高表達(dá)，提示XIAP的過(guò)表達(dá)和可能與癌癥的發(fā)展相關(guān)。最近，我們的研究表明XIAP存在一些與細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)的功能，包括周期蛋白D1的上調(diào)后促

2、進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和抑制RhoGDIα的賴氨酸138位點(diǎn)的SUMO化來(lái)促進(jìn)F肌動(dòng)蛋白的形成和結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲等。另有其他的研究報(bào)道XIAP過(guò)表達(dá)和癌癥患者的癌癥發(fā)展，藥物抵抗和不良預(yù)后相關(guān)。
　　XIAP其氨基末端有三個(gè)重復(fù)的BIR結(jié)構(gòu)域，和羧基末端的RING結(jié)構(gòu)域。BIR結(jié)構(gòu)域可抑制半胱天冬酶3、7和9，主要負(fù)責(zé)XIAP抑制細(xì)胞凋亡的功能，羧基末端的RING結(jié)構(gòu)域，表現(xiàn)出E3泛素連接酶的活性，使IAP通過(guò)蛋白酶體引起自身泛素化，

3、半胱天冬酶3，7泛素化。近來(lái)，我們發(fā)現(xiàn)XIAP的BIR結(jié)構(gòu)域能夠直接結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2F1并增加它的反式激活能力。相反，XIAP RING結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)功能和分子機(jī)制尚不完全清楚。我們之前的報(bào)道闡明了RING結(jié)構(gòu)域具有抑制RhoGDIα的賴氨酸138位點(diǎn)的泛素化和抑制F肌動(dòng)蛋白形成和人結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲等部分功能。
　　在腫瘤抑制基因P53發(fā)現(xiàn)的20年間，我們又發(fā)現(xiàn)了p63和p73基因。p63蛋白是轉(zhuǎn)錄因子p53蛋白家族的成員之一，對(duì)上

4、皮組織的發(fā)展非常重要。現(xiàn)已經(jīng)表明p63基因缺陷的小鼠存在一些發(fā)育缺陷，缺少四肢、牙齒和乳腺等。p63基因通過(guò)不同的啟動(dòng)子編碼兩種主要的異構(gòu)體，TAp63和△Np63，具有不同的轉(zhuǎn)錄能力。TAp63包含一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(TAD)，可啟動(dòng)p53相關(guān)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，例如p21、bax、mdm2和其他特異的靶基因，然而△Np63缺乏轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(TAD)。盡管腫瘤的形成機(jī)制尚未完全清楚，但仍有報(bào)道稱p63的缺失可導(dǎo)致自發(fā)性腫瘤的形成。p63

5、α是p63最長(zhǎng)的TA轉(zhuǎn)錄組變體，作為腫瘤抑制因子阻止癌癥的發(fā)展。然而，大部分已有的研究主要集中于p63α調(diào)控的下游效應(yīng)因子，對(duì)于p63α的上游調(diào)控機(jī)制了解很少。這激發(fā)我們開(kāi)展目前的研究工作。
　　本課題的研究讓我們更加深入的了解XIAP及其RING結(jié)構(gòu)域和p63α在膀胱上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用，并為膀胱癌預(yù)防和治療提供一些潛在的新靶點(diǎn)。
　　二、方法:
　　1.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)共同研究XIAP RING結(jié)構(gòu)域?qū)63α的調(diào)控

6、:
　　首先體外實(shí)驗(yàn)，在正常膀胱上皮細(xì)胞系UROtsa中轉(zhuǎn)染特異性敲減XIAP的shRNA，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株后檢測(cè)p63α的表達(dá)情況，另外，在UROtsa中分別過(guò)表達(dá)XIAP(△BIR)和XIAP(△RING)結(jié)構(gòu)域，建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系后檢測(cè)p63α的表達(dá)情況。其次在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，利用RING缺失的XIAP敲入小鼠，提取小鼠的膀胱上皮細(xì)胞，通過(guò)WB檢測(cè)p63α的表達(dá)情況。
　　2.細(xì)胞非貼壁依賴性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)XIAP RING結(jié)構(gòu)域和

7、p63α對(duì)膀胱上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響:
　　利用EGF可以誘導(dǎo)UROtsa細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)的細(xì)胞模型，對(duì)XIAP RING結(jié)構(gòu)域和p63α在誘導(dǎo)膀胱上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用，用已經(jīng)建立好的UROtsa敲減XIAP和相應(yīng)對(duì)照的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞做細(xì)胞非貼壁依賴性實(shí)驗(yàn)，用EGF誘導(dǎo)其惡性轉(zhuǎn)化，明確XIAP對(duì)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用。利用UROtsa中分別過(guò)表達(dá)XIAP(△BIR)和XIAP(△RING)結(jié)構(gòu)域和相應(yīng)對(duì)照組做細(xì)胞非貼壁依賴性實(shí)驗(yàn)，確定是由

8、XIAP的哪個(gè)結(jié)構(gòu)域參與了對(duì)膀胱上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的調(diào)控。因?yàn)閁ROtsa中過(guò)表達(dá)XIAP(△BIR)后p63α升高，在此過(guò)表達(dá)XIAP(△BIR)中轉(zhuǎn)染特異性敲減p63α的shRNA和它的對(duì)照組Nonsense，并建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，比較這兩株細(xì)胞系對(duì)EGF誘導(dǎo)上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響。
　　3.XIAP RING結(jié)構(gòu)域影響p63α表達(dá)的分子機(jī)制研究:
　　利用反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)UROtsα中敲減XIAP和UROtsa中過(guò)表達(dá)XIA

9、P(△BIR)與其相應(yīng)對(duì)照組細(xì)胞間p63αmRNA的表達(dá)情況。利用蛋白翻譯抑制劑CHX處理UROtsα中敲減XIAP和UROtsa中過(guò)表達(dá)XIA P(△BIR)與其相應(yīng)對(duì)照組細(xì)胞，抑制p63α的翻譯后，比較p63α的降解速率。利用35S標(biāo)記蛋氨酸，半胱氨酸標(biāo)記新合成的蛋白，通過(guò)用特異性抗p63α的抗體沉淀p63α，并通過(guò)放射自顯影檢測(cè)比較UROtsa中敲減XIAP和對(duì)照細(xì)胞組間新和成的p63α的速率。利用螢光素酶報(bào)告載體，將p63α的3

10、'UTR區(qū)域通過(guò)PCR構(gòu)建至pmir-report載體中，將帶有p63α3'UTR的螢光素酶報(bào)告載體和TK一起轉(zhuǎn)入U(xiǎn)ROtsa敲減XIAP和相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞，UROtsa中過(guò)表達(dá)XIAP(△BIR)結(jié)構(gòu)域和相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞，以TK為內(nèi)參，比較p63α3'UTR活性的改變。
　　4.分析XIAP RING結(jié)構(gòu)域調(diào)控的可以影響p63α翻譯的miRNA:
　　利用在線分析網(wǎng)站targetscan分析可以結(jié)合到p63α3'UTR的miRNA

11、，合成相應(yīng)的miRNA的引物，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR，比較這些miRNA在UROtsa敲減XIAP和相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞，UROtsa中過(guò)表達(dá)XIAP(△BIR)結(jié)構(gòu)域和相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞中的差別，從而篩選出可能可以結(jié)合到p63α3'UTR并調(diào)控p63α翻譯的miRNA。通過(guò)在UROtsa中過(guò)表達(dá)該miRNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)效率，用WB檢測(cè)該miRNA過(guò)表達(dá)后對(duì)p63α的影響，而從明確該miRNA參與XIAP RING結(jié)構(gòu)域?qū)63α

12、翻譯的調(diào)節(jié)。
　　5.驗(yàn)證調(diào)節(jié)p63α翻譯的miR-4295對(duì)膀胱上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響:
　　用細(xì)胞非貼壁依賴性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UROtsa中過(guò)表達(dá)該miRNA后對(duì)EGF誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響，而從明確miR-4295參與XIAP RING結(jié)構(gòu)域?qū)63α翻譯的調(diào)節(jié)和上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響。
　　6.XIAP RING結(jié)構(gòu)域?qū)φ{(diào)節(jié)p63α翻譯的miR-4295調(diào)控分子機(jī)制研究:
　　利用NCBI分析miR-429

13、5在基因組上的具體位置，主要分析miR-4295是獨(dú)立表達(dá)還是和某個(gè)宿主基因一起表達(dá)。利用反轉(zhuǎn)錄PCR比較miR-4295宿主基因VTI1A在UROtsa敲減XIAP和相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞，UROtsa中過(guò)表達(dá)XIAP(△BIR)結(jié)構(gòu)域和相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞中的差別，從而明確XIAP RING結(jié)構(gòu)域調(diào)控miR-4295的可能途徑。
　　三、結(jié)果:
　　1.在體內(nèi)外的膀胱上皮細(xì)胞中，XIAP可通過(guò)其RING結(jié)構(gòu)域特異的抑制p63α蛋白表達(dá)。<

14、br>　　WB結(jié)果表明XIAP能抑制p63α蛋白的表達(dá)。異源表達(dá)HA-△BIR可抑制UROtsa細(xì)胞中p63α蛋白的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)HA-△RING并沒(méi)有顯示這些生物學(xué)功能。在XIAP△RING結(jié)構(gòu)域基因敲入小鼠中證實(shí)了XIAP RING結(jié)構(gòu)域?qū)63α表達(dá)的抑制效應(yīng)，表明p63α蛋白的表達(dá)在XIAP△RING基因敲入小鼠的膀胱上皮細(xì)胞中比XIAP-WT小鼠更高，在XIAP△RING基因敲入的小鼠中發(fā)現(xiàn)p63α表達(dá)上調(diào)。我們的結(jié)果表明了，

15、XIAP的RING結(jié)構(gòu)域?qū)w內(nèi)外膀胱上皮細(xì)胞中p63α蛋白的表達(dá)都起了抑制效應(yīng)。
　　2.p63α的下調(diào)對(duì)XIAP RING結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的人膀胱上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。
　　細(xì)胞非貼壁依賴性實(shí)驗(yàn)證明了，XIAP促進(jìn)人膀胱上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化主要是通過(guò)其RING結(jié)構(gòu)域，在UROtsa穩(wěn)定過(guò)表達(dá)HA-△BIR結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞中再轉(zhuǎn)入p63α過(guò)表達(dá)的質(zhì)粒，比較其細(xì)胞非貼壁依賴性生長(zhǎng)能力，發(fā)現(xiàn)p63α回轉(zhuǎn)后可明顯抑制UROtsa穩(wěn)定過(guò)表

16、達(dá)HA-△BIR結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞的受EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞非貼壁依賴性生長(zhǎng)的能力，表明了p63α的下調(diào)對(duì)XIAP RING結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的人膀胱上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。
　　3.XIAP RING結(jié)構(gòu)域抑制人膀胱UROtsa細(xì)胞中p63α蛋白的翻譯。
　　反轉(zhuǎn)錄PCR比較UROtsa(shXIAP)和UROtsa(HA-△BIR)與對(duì)照組細(xì)胞UROtsa(Nonsense)和UROtsa(Vector)中p63α的mRNA水平，顯示并

17、無(wú)顯著差別，蛋白合成抑制劑CHX作用下，在UROtsa(shXIAP)和UROtsa(Nonsense)中檢測(cè)p63α蛋白的降解速率。結(jié)果顯示，p63α蛋白在UROtsa(shXIAP)細(xì)胞中的降解速率比UROtsa(Nonsense)中的要快。短期的蛋白合成脈沖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)比較UROtsa(shXIAP)和UROtsa(Nonsense)細(xì)胞中p63α的蛋白翻譯速率，35S標(biāo)記的甲硫氨酸和半胱氨酸用來(lái)新合成p63α蛋白，相同時(shí)間內(nèi)UROt

18、sa(shXIAP)細(xì)胞合成的新蛋白比UROtsa(Nonsense)明顯增加。說(shuō)明XIAP RING結(jié)構(gòu)域抑制人膀胱UROtsa細(xì)胞中p63α蛋白的表達(dá)在翻譯水平。
　　4.miR-4295通過(guò)靶向結(jié)合p63α mRNA3'UTR來(lái)介導(dǎo)RING結(jié)構(gòu)域抑制p63α的蛋白翻譯。
　　用p63α3'UTR熒光素酶報(bào)告載體比較p63α3'UTR UROtsa(Nonsense)和UROtsa(shXIAP)細(xì)胞，UROtsa(Ve

19、ctor)和UROtsa(HA-△BIR)細(xì)胞中的活性，XIAP敲減后顯著提高了p63α3'UTR的活性，而異源表達(dá)HA-△BIR顯著抑制了p63α3'UTR的活性，揭示了XIAP RING結(jié)構(gòu)域通過(guò)作用于p63α mRNA的3'UTR抑制p63α蛋白的翻譯。在線Targetscan6.2軟件來(lái)分析miR-4295能結(jié)合p63α mRNA3'UTR，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示miR-4295的表達(dá)在UROtsa(shXIAP)細(xì)胞中是受

20、抑制的，而在UROtsa(HA-△BIR)中是顯著上升的，miR-4295的表達(dá)和預(yù)期調(diào)控p63αmRNA的3'UTR活性是一致的，結(jié)果提示了miR-4295通過(guò)靶向結(jié)合p63α mRNA3'UTR來(lái)介導(dǎo)RING結(jié)構(gòu)域抑制p63α的蛋白翻譯。
　　5.miR-4295介導(dǎo)RING結(jié)構(gòu)域促進(jìn)UROtsa細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。
　　我們構(gòu)建了過(guò)表達(dá)miR-4295的質(zhì)粒并和p63α3'UTR熒光素酶報(bào)告載體一起穩(wěn)定轉(zhuǎn)入U(xiǎn)ROtsa細(xì)胞

21、，UROtsa細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-4295后p63α3'UTR活性明顯被抑制，同時(shí)WB檢測(cè)p63α的蛋白表達(dá)量也明顯下降，細(xì)胞非貼壁依賴性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)UROtsa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-4295以后可明顯增加EGF誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化能力。結(jié)果提示了miR-4295介導(dǎo)XIAP RING結(jié)構(gòu)域促進(jìn)UROtsa細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。
　　6.XIAP的RING結(jié)構(gòu)域通過(guò)上調(diào)Sp1蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而促進(jìn)miR-4295轉(zhuǎn)錄。
　　NCBI數(shù)據(jù)

22、庫(kù)比對(duì)找到了miR-4295的宿主基因，結(jié)果顯示miR-4295的前體由VTI1A基因的內(nèi)含子區(qū)域編碼。反轉(zhuǎn)錄PCR和WB檢測(cè)敲低XIAP基因后VTI1A的表達(dá)名明顯受抑制，然而過(guò)表達(dá)HA-△BIR提高了VTI1A的蛋白和mRNA水平的表達(dá)。VTI1A啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告載體比較兩對(duì)細(xì)胞UROtsa(Nonsense)細(xì)胞和UROtsa(shXIAP)細(xì)胞，UROtsa(vector)細(xì)胞和UROtsa(HA-△BIR)細(xì)胞中VTI1A啟

23、動(dòng)子，結(jié)果顯示，VTI1A啟動(dòng)子熒光報(bào)告基團(tuán)的轉(zhuǎn)錄活性在UROtsa(shXIAP)細(xì)胞中顯著下調(diào)，在UROtsa(HA-△BIR)細(xì)胞中上調(diào)，表明XIAP RING結(jié)構(gòu)域?qū)TI1A和miR-4295的調(diào)控在轉(zhuǎn)錄水平。比較可結(jié)合至VTI1A啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Sp1的表達(dá)水平及活性與VTI1A啟動(dòng)子活性一致，提示XIAP的RING結(jié)構(gòu)域通過(guò)上調(diào)Sp1蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性來(lái)促進(jìn)miR-4295轉(zhuǎn)錄。
　　四、結(jié)論:

24、
　　在目前的研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)敲減XIAP的表達(dá)后可誘導(dǎo)p63α蛋白的上調(diào)，然而在正常膀胱上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)XIA(△BIR)后可下調(diào)p63α的表達(dá)。這與RING缺失的XIAP敲入小鼠的膀胱組織中的表現(xiàn)一致，證明了XIAP RING結(jié)構(gòu)域在體內(nèi)外膀胱上皮細(xì)胞對(duì)p63α表達(dá)的新型抑制效應(yīng)。我們接下來(lái)的功能研究也揭示了，XIAP RING結(jié)構(gòu)域?qū)63α蛋白表達(dá)的抑制，對(duì)表皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)人正常膀胱上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化非常重要。進(jìn)一步的

25、機(jī)制研究揭示了XIAP RING結(jié)構(gòu)域能夠啟動(dòng)miR-4295的轉(zhuǎn)錄，而miR-4295可以靶向作用于p63αmRNA的3，UTR，從而抑制p63α蛋白的翻譯。而且，XIAP RING在人膀胱上皮細(xì)胞中上調(diào)Sp1蛋白對(duì)miR-4295的轉(zhuǎn)錄表達(dá)非常重要，Sp1作為轉(zhuǎn)錄因子可以激活miR-4295的宿主基因VTI1A的轉(zhuǎn)錄，從而增加miR-4295的表達(dá)量?？偟膩?lái)說(shuō)，我們的研究揭示了XIAP RING結(jié)構(gòu)域在體內(nèi)外的一個(gè)新功能，即通過(guò)上調(diào)

26、Sp1表達(dá)來(lái)增加miR-4295的轉(zhuǎn)錄，從而降低p63α蛋白的翻譯，最終導(dǎo)致及膀胱上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。
　　第二部分膀胱癌非轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系T24和其轉(zhuǎn)移性衍生態(tài)T24T在細(xì)胞侵襲和遷移能力的不同表現(xiàn)及具體機(jī)制研究
　　一、背景和目的:
　　癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力的獲得是發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。先前的研究認(rèn)為遷移和浸潤(rùn)時(shí)具有相同的生物學(xué)意義，但我們最近的研究結(jié)果顯示它們是兩個(gè)不同的事件。細(xì)胞遷移包含大量步驟:細(xì)胞與細(xì)胞間黏附的消失、細(xì)

27、胞膜向運(yùn)動(dòng)方向突出，前端和尾端與細(xì)胞外基質(zhì)黏著解離，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架收縮驅(qū)動(dòng)胞體向前。癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移同樣包含很多步驟:滲入連接組織、進(jìn)入血液和免疫系統(tǒng)、在遠(yuǎn)隔器官形成一個(gè)新的腫瘤。
　　超氧化物歧化酶(SOD)是一種能夠催化超氧化物通過(guò)歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氧氣和過(guò)氧化氫的酶。線粒體電子傳遞鏈產(chǎn)生有毒的超氧化物，SOD2可將其轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫和二價(jià)氧，并參與活性氧的反應(yīng)過(guò)程。最近的研究顯示，SOD2在高級(jí)別和晚期膀胱癌中持續(xù)增加并在癌癥的發(fā)展

28、和轉(zhuǎn)移發(fā)揮著重要作用。Rho-GTPases包括CDC42和Rac1，它們?cè)谡{(diào)控細(xì)胞遷移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，參與黏附、附著解離、去黏附、極化和細(xì)胞骨架機(jī)化。由于CDC42和Rac1在細(xì)胞遷移中的重要性，細(xì)胞中這些GTPases自然平衡的打亂最終將導(dǎo)致表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移表型。SOD2、CDC42/Rac1和JNK/c-Jun已被大家熟知參與癌癥的發(fā)展和遷移。然而，SOD2、CDC42/Rac1和JNK/c-Jun在膀胱癌浸潤(rùn)和遷移中的作用仍然未

29、知。
　　細(xì)胞外基質(zhì)的水解對(duì)癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移十分重要，腫瘤細(xì)胞通過(guò)分泌蛋白如MMP-2和MMP-9來(lái)促進(jìn)水合作用。MMP-2也被稱為72KDa的Ⅳ型膠原酶，降解基底膜的一個(gè)主要結(jié)構(gòu)成分Ⅳ型膠原。MMP-2被報(bào)道參與多數(shù)癌癥的轉(zhuǎn)移，包括結(jié)直腸癌、卵巢癌和乳腺癌等，但與膀胱癌的關(guān)系尚不明確。
　　為了探究參與膀胱癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)的這些分子的生物學(xué)意義，我們對(duì)比研究了一對(duì)具有不同轉(zhuǎn)移特征的同源的膀胱癌細(xì)胞系T24和T24T的遷移

30、和浸潤(rùn)能力和它們潛在的機(jī)制。雖然T24細(xì)胞具有有限的轉(zhuǎn)移能力，但其衍生細(xì)胞系T24T細(xì)胞具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。檢測(cè)上述分子在T24和T24T細(xì)胞中蛋白和mRNA的表達(dá)水平，并探究這些蛋白質(zhì)間的潛在關(guān)系。本課題為研究膀胱癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)的分子基礎(chǔ)提供了新的觀點(diǎn)，揭示了針對(duì)膀胱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的新的治療靶點(diǎn)。
　　二、方法:
　　1.比較高度轉(zhuǎn)移的人膀胱癌T24T細(xì)胞和其同源T24細(xì)胞中遷移與浸潤(rùn)能力。
　　利用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)，比較

31、人膀胱癌T24T細(xì)胞和其同源T24細(xì)胞間的遷移能力，通過(guò)細(xì)胞浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)，比較人膀胱癌T24T細(xì)胞和其同源T24細(xì)胞間的細(xì)胞浸潤(rùn)能力
　　2.T24T比T24具有較低遷移能力的分子機(jī)制研究。
　　WB分析可能的可以參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的小GTP酶CDC42、Rac1、RhoA和SOD2的表達(dá)水平。利用realtime-PCR檢測(cè)CDC42和Rac1的mRNA水平。將特異性靶向SOD2的小發(fā)夾RNA(shSOD2)轉(zhuǎn)染到T24T細(xì)胞中

32、，比較T24T(nonsense)和T24T(shSOD2)細(xì)胞間的小GTP酶表達(dá)水平和細(xì)胞遷移能力。
　　3.SOD2抑制T24T細(xì)胞遷移能力的分子機(jī)制研究。
　　比較T24和T24T，T24T(nonsense)和T24T(shSOD2)細(xì)胞間的MAPK通路中的JNK，Erk，p38的表達(dá)情況，篩選出受SOD2調(diào)控的某一條通路。并在T24T(shSOD2)細(xì)胞中抑制c-Jun后比較對(duì)小GTP酶表達(dá)水平和細(xì)胞遷移能力的影響

33、。
　　4.SOD2受調(diào)控表達(dá)的分子機(jī)制研究。
　　RT-PCR檢測(cè)T24和T24T細(xì)胞間SOD2的mRNA水平，從而確定SOD2受調(diào)控是否在mRNA水平。我們把SOD2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告載體轉(zhuǎn)染到T24細(xì)胞和T24T細(xì)胞中，檢測(cè)和比較兩種細(xì)胞系中SOD2的啟動(dòng)子活性和轉(zhuǎn)錄表達(dá)能力。用啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子分析網(wǎng)站分析了能結(jié)合SOD2啟動(dòng)子區(qū)域的潛在轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)敲減相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)驗(yàn)證對(duì)SOD2啟動(dòng)子活性，SOD2

34、mRNA水平，SOD2蛋白水平和細(xì)胞遷移能力的影響，從而篩選出調(diào)控SOD2表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。
　　5.T24T比T24具有較高浸潤(rùn)能力的分子機(jī)制研究。
　　首先比較T24T敲減SOD2后對(duì)細(xì)胞浸潤(rùn)能力的影響，WB和RT-PCR結(jié)合分析可能的可以參與調(diào)節(jié)細(xì)胞浸潤(rùn)能力的蛋白:MMP-2，MMP-9和VEGE將MMP-2特異性的shRNA轉(zhuǎn)染到T24T細(xì)胞，構(gòu)建T24T shMMP-2穩(wěn)定細(xì)胞，比較敲減MMP-2以后對(duì)細(xì)胞浸潤(rùn)能力的

35、影響。
　　6.MMP-2受調(diào)控表達(dá)的分子機(jī)制研究。
　　RT-PCR檢測(cè)T24和T24T細(xì)胞間MMP-2的mRNA水平，從而確定MMP-2受調(diào)控是否在mRNA水平。將MMP-2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告載體轉(zhuǎn)染到T24和T24T細(xì)胞中，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子并用于比較MMP-2在這兩種細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性，從而確定MMP-2受調(diào)控是否在轉(zhuǎn)錄水平。用放線菌素D(Act D)處理T24和T24T，抑制其MMP-2的mRNA合成，然后比較MM

36、P-2的mRNA在T24和T24T間的降解速率，WB分析比較可以調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性的蛋白在T24和T24T間的表達(dá)情況，通過(guò)特異性敲減Nucleolin，檢測(cè)其對(duì)MMP-2的表達(dá)水平的影響和對(duì)細(xì)胞浸潤(rùn)能力的影響，從而確定其參與調(diào)節(jié)MMP-2的表達(dá)和細(xì)胞的浸潤(rùn)能力。
　　三、結(jié)果:
　　1.高度轉(zhuǎn)移的人膀胱癌T24T細(xì)胞較其同源T24細(xì)胞具有低遷移能力和高浸潤(rùn)能力。
　　為了探究T24與T24T細(xì)胞的細(xì)胞遷移，我們利用劃

37、痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，劃痕36小時(shí)后，T24細(xì)胞系已經(jīng)完全愈合，而T24T細(xì)胞只有部分愈合，表明T24T細(xì)胞與T24細(xì)胞相比具有較低的遷移能力。細(xì)胞浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，與T24細(xì)胞相比，T24T提高了其浸潤(rùn)能力，表明高細(xì)胞遷移活性并不一定意味著高浸潤(rùn)活性。
　　2.SOD2參與抑制T24T細(xì)胞遷移。
　　觀察T24和T24T細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中小GTP酶CDC42、Rac1和RhoA的表達(dá)水平。與T24細(xì)胞相比，T24T細(xì)胞中CDC42、

38、Rac1和RhoA蛋白表達(dá)明顯下降，這些結(jié)果提示了CDC42/Rac1可能參與T24T細(xì)胞的細(xì)胞遷移抑制。我們檢測(cè)了T24和T24T細(xì)胞中SOD2的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，SOD2的表達(dá)在T24T細(xì)胞中顯著升高，將特異性靶向SOD2的小發(fā)夾RNA(shSOD2)轉(zhuǎn)染到T24T細(xì)胞中，與T24T(nonsense)細(xì)胞相比，T24T細(xì)胞敲減SOD2后，CDC42和Rac1的蛋白和mRNA表達(dá)水平升高，同樣增加了細(xì)胞遷移活性。
　　3.S

39、OD2通過(guò)靶向JNK/AP-1/GTPase通路抑制T24T細(xì)胞遷移。
　　對(duì)比于T24細(xì)胞，T24T細(xì)胞中JNK和Erk的磷酸化水平明顯降低而p38僅有輕微降低;然而T24與T24T細(xì)胞的JNK、p38和Erk蛋白表達(dá)水平相近，T24TshSOD2細(xì)胞表現(xiàn)出較高的JNK、Erk和c-JUN活性，而T24T shSOD2細(xì)胞中與其空載體對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞T24T nonsense細(xì)胞相比，p38的總體水平和磷酸化水平相近，這些結(jié)果顯示S

40、OD2可抑制JNK、Erk和其下游轉(zhuǎn)錄因子c-JUN/AP-1的功能，p38可能未參與SOD2對(duì)細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)。將顯性負(fù)突變c-Jun突變體TAM67轉(zhuǎn)染到T24T shSOD2細(xì)胞中。結(jié)果顯示CDC42/Rac1表達(dá)水平和細(xì)胞遷移能力顯著下降。利用抑制劑SP600125(特異性針對(duì)JNK)和PD98059（特異性針對(duì)MEK/Erk）處理T24細(xì)胞，檢測(cè)表明SOD2是JNKs調(diào)節(jié)c-Jun活化的上游作用因子，而JNKs通過(guò)c-Jun來(lái)參

41、與SOD2對(duì)細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)，然而Erk不參與c-Jun介導(dǎo)的T24細(xì)胞的細(xì)胞遷移。
　　4.轉(zhuǎn)錄因子Sp1過(guò)表達(dá)介導(dǎo)T24T細(xì)胞SOD2的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)。
　　RT-PCR結(jié)果顯示SOD2的mRNA水平在T24T細(xì)胞中比T24細(xì)胞中高，SOD2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告載體報(bào)告在T24T細(xì)胞中SOD2啟動(dòng)子的活性比T24細(xì)胞高4倍，揭示了SOD2在T24T細(xì)胞中表達(dá)增加是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。分析了能結(jié)合SOD2啟動(dòng)子區(qū)域的潛在轉(zhuǎn)

42、錄因子，包括AP-1，STAT和多位點(diǎn)的Sp1轉(zhuǎn)錄因子。相比較T24細(xì)胞，Sp1的表達(dá)和Sp-1依賴性的轉(zhuǎn)錄活性在T24T細(xì)胞中都是顯著增加的，發(fā)現(xiàn)在T24T敲減Sp1后，細(xì)胞中SOD2蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)都是明顯降低的，相應(yīng)的，SOD2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性在T24T shSp1細(xì)胞中被抑制，同時(shí)T24T細(xì)胞的細(xì)胞遷移能力顯著增加。
　　5.MMP-2表達(dá)增加能促進(jìn)T24T細(xì)胞的浸潤(rùn)。
　　MMP-2在T24T細(xì)

43、胞中蛋白水平和mRNA水平都是增加的，而MMP-9在mRNA水平卻是減少的，VEGF并無(wú)顯著差異。將MMP-2特異性的shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到T24T細(xì)胞后，與其對(duì)照組nonsense轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，MMP-2的敲低減少了T24T細(xì)胞的浸潤(rùn)能力。
　　6.核仁素增加了MMP-2的mRNA穩(wěn)定性。
　　MMP-2的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性在T24T細(xì)胞和T24細(xì)胞間是相當(dāng)?shù)?，放線菌素D(Act D)處理后T24和T24T細(xì)胞，RT-PCR結(jié)果

44、顯示，MMP-2在T24T細(xì)胞中mRNA的半衰期比T24細(xì)胞中更長(zhǎng)，揭示了T24T細(xì)胞內(nèi)由于MMP-2 mRNA穩(wěn)定性增加MMP-2呈高水平表達(dá)。可以影響mRNA穩(wěn)定性的蛋白AUF1和HuR在T24和T24T細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平都是相近的，但是核仁蛋白在T24T細(xì)胞中是升高的，在用RNA免疫共沉淀RNA-IP分析，結(jié)果顯示核仁蛋白能特異性的結(jié)合到MMP-2 mRNA上，特異性敲減核仁蛋白的表達(dá)后，導(dǎo)致了MMP-2表達(dá)減少，同時(shí)也抑制了細(xì)

45、胞的浸潤(rùn)能力。
　　四、結(jié)論:
　　先前關(guān)于癌細(xì)胞浸潤(rùn)的研究主要集中在它的遷移能力，因?yàn)檫@兩個(gè)事件常被認(rèn)為具有相同生物學(xué)意義，認(rèn)為腫瘤細(xì)胞具有高遷移能力則等同于具有高浸潤(rùn)能力。而我們的研究發(fā)現(xiàn)T24T細(xì)胞比T24細(xì)胞具有更高的浸潤(rùn)能力和較低的遷移能力。T24T細(xì)胞與T24細(xì)胞相比，Rho-GDPases表達(dá)較低而SOD2表達(dá)較高。事實(shí)上，我們?cè)赥24T細(xì)胞中敲減SOD2后可明顯降低細(xì)胞遷移，而對(duì)細(xì)胞浸潤(rùn)能力卻沒(méi)有影響。重要的