在工程菌中過量表達(dá)龍膽IPI基因提高類胡蘿卜素產(chǎn)量的研究.pdf

1、類胡蘿卜素在保護(hù)人類健康方面起著重要的作用。人體不能自身合成類胡蘿卜素，主要依賴從食物中攝取。大多數(shù)作物的類胡蘿卜素含量較低，不能滿足人體需求。在很多發(fā)展中國家，以類胡蘿卜素為前體的維生素A的缺乏癥發(fā)病率位于各類微量營養(yǎng)素缺乏癥之首，參與視黃斑合成的玉米黃質(zhì)，預(yù)防腫瘤的番茄紅素等類胡蘿卜素的缺乏問題也十分嚴(yán)重。目前類胡蘿卜素缺乏癥患者主要通過化學(xué)合成的類胡蘿卜素進(jìn)行補(bǔ)充。但化學(xué)合成類胡蘿卜素存在很多弊端，如工藝復(fù)雜，產(chǎn)物種類較少；得到的

2、最終產(chǎn)品是目標(biāo)產(chǎn)物及其衍生物的混合物，有不可預(yù)知的副作用；長期服用對健康不利等。利用基因工程手段，在生物體內(nèi)合成類胡蘿卜素有效克服了這些弊端。生物合成類胡蘿卜素的產(chǎn)物種類豐富，生產(chǎn)工藝簡單，不會產(chǎn)生自然界中不存在的衍生物，補(bǔ)充方法簡便易行，發(fā)展前景也較為廣闊。目前多種微生物和高等植物中類胡蘿卜素的合成途徑已基本清晰。合成途徑中幾乎全部酶基因已得到分離和克隆，這為進(jìn)一步的基因操作做了很好的鋪墊。 龍膽異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶(IPI)

3、cDNA核苷酸序列總長度為1146bp，含有一段708bp的不間斷開放可讀框(ORF)，197bp的5'末端和241bp的3’末端非翻譯區(qū)。在終止密碼子(TGA)和多聚腺苷酸之間沒有poly(A)加尾信號(AATAAA)。龍膽IPI基因編碼一個含235個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，分子量為27kD，等電點(diǎn)為4.84。本研究應(yīng)用基因工程技術(shù)，分別在能夠合成番茄紅素、beta-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)的工程大腸桿菌中過量表達(dá)龍膽IPI基因，以鑒定其功能，

4、并確定它是否為類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵酶。然后分別在工程大腸桿菌中過量表達(dá)玉米1-脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)、龍膽beta-胡蘿卜素羥化酶(BCH)。對比DXR、IPI過量表達(dá)對番茄紅素、beta-胡蘿卜素積累量的影響，及BCH、DXR和IPI過量表達(dá)對玉米黃質(zhì)積累量的影響，以尋求更大限度產(chǎn)出目標(biāo)類胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化方式。本研究利用較易于基因操作的工程大腸桿菌作為實(shí)驗(yàn)對象，在較短周期內(nèi)即可達(dá)到鑒定目的。若證明過量表達(dá)IPI確

5、實(shí)可以提高類胡蘿卜素含量，就可以進(jìn)一步在酵母和高等植物中過量表達(dá)IPI，研發(fā)出富含類胡蘿卜素的轉(zhuǎn)基因酵母和轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。酵母是較易于制成保健品的單細(xì)胞蛋白，可以工業(yè)化生產(chǎn)：農(nóng)作物更可以在日常生活中直接食用，達(dá)到健康方便的補(bǔ)充類胡蘿卜素的目的。結(jié)果表明，過量表達(dá)IPI可以大幅度提高轉(zhuǎn)基因大腸桿菌中類胡蘿卜素的積累量，IPI是類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵酶。若干轉(zhuǎn)化方式中，在含有pACCRT-EBIeu質(zhì)粒的大腸桿菌中過量表達(dá)IPI使番茄紅素